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EtG、EtS在不同温度保存血痕中的稳定性研究

2020-07-20 1865 上传者：管理员

摘要：目的：建立血痕（DBS）中乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）、硫酸乙酯（EtS）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的检测方法，研究不同温度保存血痕中EtG、EtS的分解规律，应用于乙醇相关案件的法医学鉴定。方法：采集8名志愿者酒后静脉血并制成血痕，均分为3组，分别保存在20℃、4℃、-20℃温度下，于保存当时（0d）、5d、9d、14d、20d、23d、26d、44d、50d，采用多反应离子监测、液相色谱-串联质谱法检测血痕中EtG、EtS的含量。结果：血痕中EtG、EtS在10ng/ml～1μg/ml之间线性范围良好，相关系数（r）≥0.998，最低检出限分别为40ng/ml、20ng/ml。不同温度保存血痕中EtG、EtS的含量均呈下降趋势，其中20℃分解最快，-20℃分解最慢，且EtS的检测时限较EtG长。结论：在乙醇相关案件的法医学鉴定中，应注意将血痕冷冻（-20℃）保存、及时送检，同时检测其中EtG、EtS的含量，避免假阴性结果的出现。

关键词：
EtG
EtS
法医毒物分析
液相色谱-串联质谱
稳定性
血痕
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近年来，我国的白酒消费人群不断增加，饮酒而引发的案件和交通事故也屡见不鲜，成为严重的社会问题。在饮酒后的短时间内，血乙醇浓度（BAC）是鉴别近期酒精摄入的直接标志物。但乙醇在人体内的代谢速度很快[1]，能够检测的时间很短，给相关案件的法医学鉴定带来困难。因此，选用合适的乙醇生物标记物就显得十分重要，相比较于血乙醇浓度，EtG、EtS等非氧化代谢物具有检出时间长、相对稳定的特点，在饮酒者体内乙醇完全消除后24h，血中仍可检测到EtG、EtS[2]。

在交通事故中，若被检人血液中未检出乙醇，可通过对事故现场残留在方向盘或安全气囊上的血痕进行EtG、EtS检测，来间接证实其是否饮酒。因此建立血痕中EtG、EtS的检测方法是法医毒物学鉴定的一个重要内容。本研究建立了血痕中EtG、EtS的检测方法，并对不同温度保存血痕中EtG、EtS的稳定性进行研究，为乙醇相关案件的法医学鉴定提供依据。

1、血痕中EtG、EtS检测方法的建立

1.1主要仪器和试剂

1.1.1仪器

1260-6460三重串联四极杆液质联用仪（LC-MS/MS）（美国Agilent公司）；MX-S可调式混匀仪（上海大龙）；SC-3610低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；SB-5200DTD超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ET3301A氮吹浓缩仪（上海欧陆科仪有限公司）；MilliporeSimplicity185超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.1.2试剂

乙基葡萄糖醛酸苷（EtG）标准品、硫酸乙酯（EtS）标准品、氘代硫酸乙酯（EtS-D5）标准品（北京百灵威科技有限公司）；氘代乙基葡萄糖醛酸苷（EtG-D5）标准品（上海甄准科技有限公司）；甲醇、乙腈（色谱级，美国sigma公司）；定性滤纸（9cm）（杭州特种纸业有限公司）。所用标准品用色谱级甲醇制得储备液，浓度为1mg/ml，在-20℃冰箱保存。实验中所用其他浓度的标准溶液均从上述储备液用甲醇稀释而得。

1.2方法

1.2.1仪器条件

色谱条件色谱柱：ZORBAXSB-C18(4.6×150mm,5μm）；流动相：水-乙腈：90-10；柱温：25℃；流速为0.4ml/min；进样5μl。

质谱条件电喷雾离子源（ESI+）；检测模式：多反应监测（MRM）；雾化干燥气温度（TEM):300℃；气流速(GasFlow):11L/min；离子喷雾电压（IS):4000V；雾化器压力（Nebulizer):15psi。待测物的碰撞诱导解离电压（Fragmentor）、碰撞能量（CE）等参数见表1。

表1EtG、EtG-D5、EtS、EtS-D5的质谱参数

1.2.2样品处理

沿血滴边缘0.5cm处将血痕剪下，剪碎后装入15ml离心管，加入3ml甲醇、20μl内标混合液（EtG-D5、EtS-D5、50μg/ml、25μg/ml），震摇15min，水浴超声10min,5000r/min离心15min，取上清于玻璃试管中，40℃氮气吹干，200μl甲醇定容、过膜，5μl进样。

1.3结果

1.3.1色谱分析

血痕中EtG、EtS的MRM色谱图见图1。

图1血痕中EtG、EtS的MRM色谱图

1.3.2线性范围及最低检测浓度

取空白人血分别配制成10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、250ng/ml、500ng/ml、1μg/ml的工作液，滴于滤纸上制成血痕，按照1.2.2项进行处理，用LC-MS/MS进行分析。以目标物浓度（ng/ml）为横坐标（X），以目标物和内标物峰面积比值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，建立线性回归方程，详细结果见表2。

表2血痕中EtG、EtS的工作曲线及最低检测限

1.3.3准确度、精密度和提取回收率

取空白人血分别配制成50ng/ml、500ng/ml、1μg/ml的工作液，滴于滤纸上制成血痕。每个浓度3个平行样本，按照1.2.2项进行处理，用LC-MS/MS进行分析。每日测定3次，连续测定3d，得到日内、日间精密度，并根据工作曲线计算准确度和提取回收率。详见表3。

表3血痕中EtG、EtS的准确度、精密度和提取回收率

2、血痕中EtG、EtS的稳定性研究

2.1受试者

志愿者8名（全部男性），年龄20～30周岁。所有志愿者受试前一个月内无酒精摄入，无基础疾病和酒精过敏史。

2.2样本采集

志愿者在饭后1h以0.68g乙醇/kg体重为计量单位，于15min内，伴食饮用相应体积的中国白酒（超市采购40°汾酒）。饮酒后3h从肘静脉采血40ml，分装于肝素钠采血管中。

2.3模型建立

取100μl静脉血滴加于干燥滤纸上，置于通风处晾干6h。分别保存在4℃、20℃和-20℃条件下，于不同的时间点检测EtG、EtS的含量。

2.4稳定性研究

不同温度保存血痕中EtG、EtS的平均含量变化以及与初始含量百分比，分别见表4～表7，图2、图3。

表4不同温度保存血痕中EtG的平均含量变化

表5不同温度保存血痕中EtG的含量与初始含量百分比

表6不同温度保存血痕中EtS的平均含量变化

表7不同温度保存血痕中EtS的含量与初始含量百分比

图2不同温度保存血痕中EtG的平均含量变化

图3不同温度保存血痕中EtS的平均含量变化

3、讨论

3.1血痕中EtG、EtS检测方法

目前国内关于血痕的研究主要集中在血痕组织的来源分析[3]、血痕中常见烟草、毒品、药品的检测[4]等方面，关于血痕中EtG、EtS检测方法的报道较少。国外针对血痕中EtG、EtS的研究较为广泛，如联合头发中EtG、尿液中EtG、EtS以及血痕中乙基磷酸酯三种检测技术来评价近期酒精摄入的情况[5]、LC-MS/MS检测血痕中EtG、EtS[6]以及不同表面的血痕中EtG的检测[7]。本实验建立了血痕中EtG、EtS的LC-MS/MS检测方法，最低检测限分别为40ng/ml、20ng/ml，提取回收率分别为88%、94%，该方法较国外[6]检测方法（最低检测限为100ng/ml，提取回收率分别为43%、48%）灵敏度和回收率高、重现性好，适合痕量检材的检测。

3.2血痕中EtG、EtS稳定性

乙醇的主要毒理作用是抑制中枢神经系统。呼吸中枢麻痹是引起死亡的主要原因[8]。乙醇在体内的代谢途径主要是通过酶的作用而发生氧化、水解，仅有少部分经非氧化代谢途径产生EtG、EtS等非氧化代谢物排出体外。由于乙醇在体内代谢快、检测时间短，故将EtG、EtS作为酒精摄入代谢产物的标志物。国内针对EtG、EtS的研究主要集中在血液、尿液、头发等生物检材上，更是缺乏对血痕中EtG、EtS的研究。在国内外文献中，尚未见有关血痕中EtG、EtS稳定性研究的报道。因此针对血痕中EtG、EtS的检测以及血痕中EtG、EtS稳定性的研究显得十分重要。

本实验建立了血痕中EtG、EtS的LC-MS/MS检测方法，通过模拟醉酒状态，采集志愿者酒后静脉血并制成血痕，来研究不同温度下血痕中EtG、EtS的稳定性。研究结果表明，不同温度保存血痕中EtG、EtS均发生分解，其中20℃分解最快，-20℃最慢。不同温度保存血痕中EtG的检测时限为26d～44d,EtS的检测时限在50天以上。因此，在乙醇相关案件的法医学鉴定中，应注意将血痕冷冻保存，及时送检，同时检测其中EtG、EtS的含量，避免假阴性结果的出现。

参考文献：

[3]林清峦,胡兰,王冲.基于mRNA检测技术的现场血痕组织来源分析[D].中国人民公安大学,2017.

[4]向丽君,张云峰,薛敏,等.UPLC-MS/MS法检测血痕中常见烟草､毒品和药物成分[J].中国法医学杂志,2014,29(3):206-213.

路玉平,赵辛,黄博,王颖,栗俊凯,马红娟,傅善林,刘耀,丛斌,贠克明,尉志文.不同温度保存血痕中EtG､EtS的稳定性研究[J].中国法医学杂志,2020,35(03):243-247.

基金:国家重点研发计划课题(2017YFC0803504､2018YFC0807403);国家科技基础专项(SQ2015FYJ010051).