糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病患者常见的并发症之一,是导致失明的主要原因,典型表现为新生血管形成､血管渗漏､出血､视网膜损伤和视力丧失[1]｡DR的发病机制涉及多种因素的高度复杂的相互作用,血糖水平升高､炎症反应､内皮功能障碍和氧化应激都被认为与病情进展密切相关[2]｡目前,我们对DR有初步的了解,但其发展的确切分子机制仍然不完全清楚｡MicroRNA(miRNA)是由20-24个核苷酸组成的短的非编码RNA分子,它们通过特异性结合mRNA的3’⁃非翻译区(3’⁃UTR),在调节蛋白质翻译或降解中起关键作用,从而控制基因表达[3]｡新兴研究揭示了miRNA在DR发展中不可或缺的作用｡例如,miR⁃124通过抑制小胶质细胞炎症反应预防大鼠DR[4]｡此外,miR⁃138⁃5p通过调节NOVA1保护早期DR[5]｡然而,miR⁃155⁃5p在DR中的具体作用仍有待研究｡因此,本研究使用DR细胞模型,探究miR⁃155⁃5p对细胞模型生物学功能的影响,最终目的是揭示其在DR发病机制中的复杂调控机制,为DR的诊断和治疗提供参考｡

1、材料与方法

1.1细胞､试剂和仪器

ARPE⁃19细胞购自武汉普诺赛生物公司(货号:CL⁃0026);D/F12细胞培养液(货号:MA0214)､PBS(货号:MA0015)､胎牛血清(货号:PWL001)､胰蛋白酶(MA0233)､青链霉素(货号:MA0110)和CCK⁃8(货号:MA0218)试剂盒购自大连美仑生物公司;凋亡试剂盒(货号:E606336)､逆转录试剂盒(货号:B639251)和SYBR检测试剂盒(货号:B110031)购自上海生工生物公司;Trizol(货号:93289)购自美国sigma公司;RT⁃PCR引物､SIRT1⁃3’UTR⁃WT和SIRT1⁃3’UTR⁃MUT荧光素酶报告载体､pcDNA3.1⁃SIRT1过表达载体合成自上海生工公司;一抗P62(货号:AF5384)､LC3B(货号:AF4650)､NLRP3(货号:DF15549)､IL⁃1β(货号:AF5103)､Caspase⁃1(货号:AF4005)､SIRT1(货号:DF6033)和GAPDH(货号:AF7021)购自美国Affinity公司;miR⁃155⁃5p⁃mimics(货号:miR1180504053308⁃1⁃5)和miR⁃155⁃5pinhibitor(货号:miR2180507090400⁃1⁃5)购自广州锐博生物公司;荧光定量PCR仪购自美国BioRad(CFXConnect);酶标仪购自美国TECAN公司(Sun⁃rise);流式细胞仪购自美国BD公司(FACSCalibur);蛋白生物分子成像仪购自美国GE公司(LAS4000)｡

1.2细胞培养

ARPE⁃19细胞使用D/F12(体积分数10%的胎牛血清)培养液培养,培养条件:37℃与体积分数5%CO2条件下培养｡

1.3实验方法

1.3.1DR患者血液中miR⁃155⁃5p表达水平检测

收集锦州医科大学附属第一医院眼科12份外周血标本,其中健康人6例血标本设为对照组,DR患者血标本6份设为DR组｡Trizol法提取2组血液样本的总RNA,定量浓度后行逆转录反应,得到的cDNA作为模板进行RT⁃PCR检测,检测2组血液样本中miR⁃155⁃5p的表达水平｡PCR反应条件:预变性95℃2min;变性95℃15s;退火和延伸60℃30s;40个循环｡引物信息见表1｡

表1RT⁃PCR引物表

1.3.2高糖诱导DR细胞模型及对应

miR⁃155⁃5p表达水平取对数生长期的ARPE⁃19细胞,胰蛋白酶消化并计数,按照每孔2×103个的密度将细胞铺板于96孔板,后待细胞完全贴壁,配置包含0､50､100､150､200mmol·L-1葡萄糖的D/F12完全培养液,细胞替换不同高糖浓度的培养液继续培养,24h后按照每孔10μL加入CCK⁃8,37℃孵育3h后,多功能酶标仪检测450nm处吸光值｡取不同浓度高糖处理的ARPE⁃19细胞,Trizol法提取各高糖浓度下细胞的总RNA,定量浓度后行逆转录反应,得到的cDNA作为模板进行RT⁃PCR检测,检测细胞中miR⁃155⁃5p的表达水平,PCR实验方法和引物信息同上文｡

1.3.3高糖诱导后拯救实验步骤

使用miR⁃155⁃5p⁃inhibitor或其阴性对照抑制剂NC⁃inhibitor预孵育ARPE⁃19细胞24h后,加入100mmol·L-1的高糖D/F12培养液继续培养24h,分别设为HG+miR⁃155⁃5p⁃inhibitor组与HG+NC⁃in⁃hibitor组,不含葡萄糖的培养液培养的细胞设为Control组,处理方式同上｡RT⁃PCR检测各组细胞中miR⁃155⁃5p表达,CCK⁃8检测各组细胞增殖变化,流式检测各组细胞凋亡变化,RT⁃PCR和CCK⁃8方法同上文｡流式实验检测步骤:取各组的ARPE⁃19细胞,胰蛋白酶消化并计数,细胞密度8×109个·L-1,取25μL(约2×105个)每组细胞,PBS洗涤细胞2次后,0.1mLbindingbuffer重悬细胞,加入5μLAn⁃nexinV⁃FITC和10μLPI染色,混匀后室温避光孵育15min,加入0.4mLbindingbuffer补足0.5mL,在流式细胞仪中检测细胞凋亡｡

1.3.4DR模型细胞中过表达

miR⁃155⁃5p与细胞增殖及凋亡变化使用miR⁃155⁃5p⁃mimics或其阴性对照抑制剂NC⁃mimics预孵育ARPE⁃19细胞24h后,加入100mmol·L-1的高糖D/F12培养液继续培养24h,分别设为HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组与HG+NC⁃mimics组｡Trizol法提取两组细胞的总RNA,测定浓度后进行逆转录反应,得到的cDNA作为模板RT⁃PCR检测miR⁃155⁃5p的表达水平｡CCK⁃8法检测两组细胞增殖水平｡AnnexinV⁃FITC/PI法检测两组细胞凋亡水平｡

1.3.5miR⁃155⁃5p对DR细胞模型细胞自噬和炎症的影响

HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞培养方式同1.3.4,Ripa裂解两细胞提取总蛋白,BCA定量蛋白浓度后,加入5×蛋白loading⁃buffer,100℃蛋白变性10min,得到的样本经蛋白电泳､转膜､抗体(P62､LC3B､NLRP3､IL⁃1β､pro⁃caspase⁃1)孵育后在蛋白成像系统下显影｡1.3.6miR⁃155⁃5p靶基因的筛选

1.3.6.1miR⁃155⁃5p靶基因的预测

通过targetscan(https://www.targetscan.org/vert_71/)数据测预测筛选miR⁃155⁃5p的靶向基因｡

1.3.6.2过表达miR⁃155⁃5p后检测各组细胞SIRT1mRNA和蛋白表达水平

使用HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞的cDNA,RT⁃PCR检测两组细胞中SITR1的mRNA表达;使用该两组细胞的总蛋白,Westernblot检测两组细胞中SIRT1的蛋白表达水平｡

1.3.6.3双荧光素酶检测实验构建

SIRT1⁃3’UTR⁃WT和SIRT1⁃3’UTR⁃MUT双荧光素酶报告基因载体质粒,取对数生长期的ARPR⁃19细胞,按每孔5×104个的细胞密度将细胞铺板于12孔板,24h后弃上清,每孔加入0.2mLOpti⁃MEM,饥饿培养6h｡按照:(1)miR⁃155⁃5p⁃mimics+0.05μgSIRT1⁃3’UTR⁃WT;(2)miR⁃155⁃5p⁃mimics+0.05μgSIRT1⁃3’UTR⁃MUT的分组共转染miR⁃155⁃5p⁃mimics和SIRT1⁃3’UTR⁃WT和SIRT1⁃3’UTR⁃MUT质粒,设置阴性对照组HG+NC⁃mimics组,转染方式同上｡转染72h后,PBS洗涤细胞2次,PLB裂解细胞后,96孔板加入100μL的LARII试剂和20μL细胞裂解液,酶标读数,10s后加入100μL的Stop/Glo底物,再次酶标仪读数｡

1.3.7基因回复实验步骤

1.3.7.1miR⁃155⁃5p⁃mimics与SIRT1过表达质粒共转染

取对数生长期ARPE⁃19细胞,胰蛋白酶消化并计数,按每孔5×105个的细胞密度将细胞铺板于6孔板,24h后共转染miR⁃155⁃5p⁃mimics和pcDNA3.1⁃SIRT1过表达质粒0.5μg,共转染48h后待用,设为HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics+SIRT1组,仅转染miR⁃155⁃5p⁃mimics或其阴性对照抑制剂的细胞设为HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组与HG+NC⁃mimics组,转染方法同上文｡

1.3.7.2细胞增殖､凋亡水平及相关凋亡和自噬蛋白表达水平检测

取各组ARPE⁃19细胞,胰蛋白酶消化并计数,按每孔2×103个的细胞密度将细胞铺板于96孔板,24h后更换为100mmol·L-1的高糖培养液,分别在更换培养液24､48､72h后酶标仪下测定450nm处吸光值｡CCK⁃8检测各组细胞增殖水平,AnnexinV⁃FITC/PI法检测各组细胞凋亡水平｡Westernblot实验检测细胞中P62､LC3B､NLRP3､IL⁃1β及pro⁃caspase⁃1蛋白表达水平｡

1.4统计学处理

采用SPSS30统计学软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD⁃t检验,检验水准:α=0.05｡

2、结果

2.1临床样本中miR⁃155⁃5p表达水平

RT⁃PCR检测2组样本中miR⁃155⁃5p的表达,结果显示,对照组与DR组外周血标本中miR⁃155⁃5p相对表达水平分别为1.00±0.72与12.68±6.00,DR组外周血标本中miR⁃155⁃5p表达水平明显升高(t=-8.078,P<0.001)｡

2.2DR模型细胞最佳诱导浓度的筛选

通过不同浓度高糖诱导ARPE⁃19细胞形成DR细胞模型,CCK⁃8检测结果显示,48h时,0､50､100､150､200mmol·L-1葡萄糖的D/F12完全培养液中细胞相对增殖活力分别为2.64±0.13､1.76±0.11､1.39±0.10､1.07±0.03及0.74±0.03,miR⁃155⁃5p相对表达水平分别为1.00±0.08､2.74±0.37､5.21±1.23､7.74±0.94及17.80±1.87,与0mmol·L-1葡萄糖培养液中的细胞相比,其他浓度葡萄糖培养液中细胞的增殖活力均下降,miR⁃155⁃5p相对表达水平均上升,差异均有统计学意义(均为P<0.05)｡其中100mmol·L-1的高糖浓度下细胞存活率约为50%,适合作为DR细胞模型的诱导浓度,后续实验将选择100mmol·L-1作为高糖处理条件｡

2.3高糖损伤后拯救实验结果

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃inhibitor干预处理细胞,48h后检测结果显示,Control组､HG+NC⁃inhibitor组及HG+miR⁃155⁃5p⁃inhibitor组细胞相对增殖能力分别为1.30±0.01､0.87±0.00及1.13±0.02,细胞中miR⁃155⁃5p相对表达水平分别为1.00±0.09､6.80±1.38及2.85±0.32,细胞相对凋亡水平分别为6.54±0.15､16.85±0.28及11.51±0.29,与HG+NC⁃inhibitor组相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃inhibitor组细胞的增殖能力增强,细胞中miR⁃155⁃5p表达水平降低,细胞凋亡水平下降,差异均有统计学意义(均为P<0.001)｡

2.4miR⁃155⁃5p对DR模型细胞增殖及凋亡的影响

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃mimics干预处理,48h后检测结果显示,HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞相对增殖水平分别为1.02±0.01与0.91±0.01,细胞中miR⁃155⁃5p相对表达水平分别为1.01±0.22与13.05±1.83,细胞相对凋亡水平分别为7.39±0.51与14.58±0.71,与HG+NC⁃mimics组细胞相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞增殖能力降低,细胞中miR⁃155⁃5p表达水平上升,细胞凋亡水平增加,差异均有统计学意义(t=8.697､-14.214､-11.252,均为P<0.001)｡

2.5miR⁃155⁃5p对DR模型细胞自噬和炎症相关蛋白表达的影响

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃mimics干预处理,Westernblot检测结果显示,HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞中P62相对表达水平分别为1.00±0.08与0.70±0.03,LC3B相对表达水平分别为1.00±0.12与2.43±0.29,NLRP3相对表达水平分别为1.00±0.14与2.28±0.36,IL⁃1β相对表达水平分别为1.00±0.15与1.71±0.20,pro⁃caspase⁃1相对表达水平分别为1.00±0.12与1.93±0.23,与HG+NC⁃mimics组细胞相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞中自噬蛋白P62表达水平下降,自噬蛋白LC3B表达水平上升,炎症蛋白NLRP3､IL⁃1β及pro⁃caspase⁃1表达水平均上升,差异均有统计学意义(t=5.554､-7.614､-5.647､-4.727､-6.189,均为P<0.01)(图1)｡

图1Westernblot实验检测两组DR模型细胞中自噬和炎症相关蛋白条带图

2.6miR⁃155⁃5p与SIRT1互相作用关系验证

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃mimics干预处理,RT⁃PCR和Westernblot实验检测两组细胞SIRT1mRNA和蛋白表达水平变化,结果显示,HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞中SIRT1mRNA相对表达水平分别为1.00±0.12与0.29±0.04,SIRT1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.02与0.57±0.05,与HG+NC⁃mimics组细胞相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞SIRT1mRNA和蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(t=9.034､12.167,均为P<0.001)(图2)｡

图2Westernblot检测两组细胞中SIRT1蛋白表达条带图

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃mimics和SIRT1⁃3’UTR⁃WT､SIRT1⁃3’UTR⁃MUT共转染,荧光素酶检测结果显示,HG+NC⁃mimics组与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞转染SIRT1⁃3’UTR⁃WT时,荧光素酶相对活性分别为1.00±0.01与0.50±0.03,转染SIRT1⁃3’UTR⁃MUT时,荧光素酶相对活性分别为1.00±0.05与0.93±0.01｡与HG+NC⁃mimics组细胞相比,转染SIRT1⁃3’UTR⁃WT时,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组细胞荧光素酶活性下降,差异有统计学意义(t=26.740,P<0.001),转染SIRT1⁃3’UTR⁃MUT时,两组细胞荧光素酶活性比较差异无统计学意义(t=1.934,P=0.125)(图3)｡

图3miR⁃155⁃5p与SIRT1互相作用关系的结合位点图

2.7基因回复实验结果

在DR模型细胞中使用miR⁃155⁃5p⁃mimics和pcDNA3.1⁃SIRT1过表达质粒共转染,结果显示,HG+NC⁃mimics组､HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组及HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics+SIRT1组细胞相对增殖水平分别为2.49±0.17､1.26±0.04及1.90±0.00,细胞中miR⁃155⁃5p相对表达水平分别为1.00±0.12､7.62±0.91及2.52±0.30,细胞相对凋亡水平分别为5.93±0.40､11.76±0.43及8.40±0.40｡与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics+SIRT1组细胞增殖水平上升,细胞中miR⁃155⁃5p表达水平下降,细胞凋亡水平下降,差异均有统计学意义(均为P<0.01)｡

Westernblot实验检测结果显示,HG+NC⁃mimics组､HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组及HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics+SIRT1组细胞中SIRT1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.07､0.34±0.07及0.60±0.06,P62蛋白相对表达水平分别为1.00±0.08､0.47±0.06及1.11±0.26,LC3B蛋白相对表达水平分别为1.00±0.13､2.80±0.55及1.50±0.17,NLRP3蛋白相对表达水平分别为1.00±0.03､2.49±0.37及1.14±0.10,IL⁃1β蛋白相对表达水平分别为1.00±0.11､2.70±0.28及1.85±0.20,pro⁃caspase⁃1蛋白相对表达水平分别为1.00±0.13､2.09±0.35及1.06±0.18｡与HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics组相比,HG+miR⁃155⁃5p⁃mimics+SIRT1组细胞中SIRT1蛋白与P62蛋白表达水平均上升,LC3B蛋白表达水平下降,同时炎症蛋白NLRP3､IL⁃1β及pro⁃caspase⁃1表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4)｡

图4Westernblot实验检测各组细胞自噬和炎症相关蛋白条带图

3、讨论

现代饮食结构的变化和体力活动的减少导致糖尿病作为一种常见的慢性代谢疾病在世界范围内迅速流行[6]｡升高的血糖水平主要损害脆弱的微血管系统,导致视网膜血管内皮损伤,而视网膜血管是特别容易受到高血糖影响的微血管[7]｡DR是一种无症状的微血管功能障碍,刺激视网膜损伤,在DR晚期,血管变性和纤维组织的过度形成最终导致失明[8]｡长期的高血糖会破坏血管功能,促进DR的发生和发展,目前,DR的治疗主要侧重于治疗以严重的视力损害和不可逆的病理改变为特征的晚期疾病[9]｡因此,及时筛查在避免或延迟严重视力损害方面起着至关重要的作用,从而降低后续治疗成本｡

近年来,miRNA在肿瘤[10]､血管疾病[11]､糖尿病[12]和肥胖[13]等疾病中的重要功能被证实｡Zhang等[14]研究发现,miR⁃155⁃5p通过靶向CCAAT增强子结合蛋白β改善妊娠糖尿病滋养细胞的胰岛素敏感性,同时还发现,miR⁃155和细胞因子信号抑制因子1之间的相互调节还影响肾脏炎症和糖尿病肾病的发展[15]｡此外,在糖尿病性黄斑水肿患者的房水和血浆中,miR⁃155⁃5p呈显著高表达,随后在高糖处理的人视网膜微血管内皮中抑制miR⁃155⁃5p表达后高糖导致的细胞损伤得到缓解[16]｡以上证据说明,miR⁃155⁃5p具有丰富的生物学调控功能,且在糖尿病并发症中具有关键作用｡

目前miR⁃155⁃5p是否调控DR的发生､发展还存在研究空白,基于已有的研究结果显示,miR⁃155⁃5p极有可能参与调控DR｡因此,本研究使用DR患者外周血检测发现,相较于健康人,miR⁃155⁃5p在DR患者中显著高表达,随后通过高糖诱导ARPE⁃19细胞建立DR细胞模型发现,模型细胞中miR⁃155⁃5p表达量随高糖浓度呈剂量依赖性升高,同时伴随细胞增殖的剂量依赖性抑制,结合临床样本数据,miR⁃155⁃5p极可能是DR的有效分子标志物｡为证明高糖导致的细胞损伤是由miR⁃155⁃5p所引发,我们在高糖处理的同时用miR⁃155⁃5p⁃inhibitor干预治疗,结果如预期,抑制miR⁃155⁃5p的表达可以拯救因高糖导致的细胞增殖受损和凋亡现象｡在DR病理生理学中,炎症､凋亡是促进病理发展的重要因素,抑制miR⁃155⁃5p缓解细胞凋亡､促进细胞增殖将有益于DR损伤后视网膜细胞的修复｡

随后,我们在DR模型细胞中外源导入miR⁃155⁃5p⁃mimics后发现,细胞损伤和凋亡进一步加剧,同时伴随着自噬和炎症反应｡Feng等[17]发现,高糖诱导的ARPE⁃19细胞发生明显的自噬反应,通过敲低高迁移率族蛋白B1后可以抑制自噬⁃溶酶体途径从而保护糖尿病视网膜的损伤｡同时DR发展中伴随着持续的炎症反应已得到共识,本次研究证明,miR⁃155⁃5p极可能是通过诱导视网膜上皮细胞过度自噬和炎症从而诱导细胞凋亡和损伤｡

为探究miR⁃155⁃5p的损伤机制,我们通过Tar⁃getscan数据库预测筛选得到靶基因SITR1｡SIRT1是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶,对多种生物过程起着至关重要的调节作用,包括能量稳态[18]､炎症[19]､细胞凋亡[20]､自噬[21]和氧化应激[22]｡在同时患有1型糖尿病和桥本病的女性中,SIRT1已被证明可促进早期心功能障碍的发生[23]｡并且已有报道显示,在糖尿病肾病中miR⁃155⁃5p通过靶向SIRT1加剧疾病的进展[24]｡基于此,我们通过双荧光素酶实验探究在DR模型细胞中miR⁃155⁃5p是否同样和SIRT1存在结合关系,正如预期,DR模型细胞中SIRT1为miR⁃155⁃5p的靶点之一,同时过表达miR⁃155⁃5p后,细胞中SIRT1mRNA和蛋白表达均被抑制,这也初步证明miR⁃155⁃5p通过调控SIRT1的表达,促进细胞自噬从而加剧细胞的凋亡和炎症,miR⁃155⁃5p在DR中的动态变化可视为疾病严重程度的生物标志物｡

最后我们在DR模型细胞中外源导入miR⁃155⁃5p的同时过表达SIRT1,发现SIRT1可以部分抵消因miR⁃155⁃5p导致的细胞损伤,不论增殖抑制､凋亡､自噬和炎症的现象均得到不同程度的缓解,这也进一步证实了上文中miR⁃155⁃5p和SIRT1的靶向关系,DR中存在miR⁃155⁃5p⁃SIRT1的调控轴,对于DR的发展不可忽视｡无论miR⁃155⁃5p,亦或者SIRT1均可以作为DR诊断的参照物,随着最近小核酸药物递送载体和药物修饰技术的突破,我们有理由相信针对miR⁃155⁃5p或SIRT1开发小核酸药物的可行性,这对于DR患者是一福音｡本此研究为进一步了解DR的发生和发展提供了重要线索,miR⁃155⁃5p⁃SIRT1轴是DR治疗的潜在靶点｡

4结论DR患者外周血和高糖诱导的DR模型细胞中,miR⁃155⁃5p表达均明显升高,在DR模型细胞中,miR⁃155⁃5p可通过靶向SIRT1抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡､自噬和炎症反应｡

基金资助:辽宁省自然科学基金(编号:2013022001);

文章来源:娄瑞特,李兵.miR-155-5p在糖尿病视网膜病变中的作用机制和意义[J].眼科新进展,2025,45(08):603-608.