现阶段土壤盐渍化的问题已然成为了制约植物生长较大的环境因素。在盐胁迫下,植物的生理特性如光合作用、渗透调节作用、抗氧化酶系统以及细胞膜系统都会发生相应的改变。目前,全世界在遏制土壤盐渍化的蔓延、发展耐盐农业上有较多的研究,改良盐渍化危害需要亟待解决[1,2]。

菊花是我国传统名花,它有着较长的栽培历史和较高的经济价值[3]。我国切花(菊花)的生产主要是在设施内完成的,由于灌水频率高、蒸腾量较大导致水流失过快过多而残存大量的盐分,使含盐量不断增加,同时化学肥料的长期使用也会造成一定程度的土壤次生盐渍化现象。许多菊花品种缺乏对逆境胁迫的抗性,导致在盐渍土环境中生长的菊花植株其品质和产量呈下降趋势。已有大量的研究发现菊花在盐渍土中生长受损:盐胁迫会使其试管苗的生长发育受抑制,高盐浓度下植株生长缓慢,丧失分生能力[4];同时高浓度的盐胁迫可通过降低菊花的光合作用来抑制其生长,破坏细胞原有的离子平衡和渗透平衡,进而破坏膜细胞,对其造成氧化伤害[5]。

对于盐渍土的开发利用一般通过工程措施和生物防治2种方式来解决。相对来说前者成本较高,难度较大,后者主要通过栽培育种、基因调控和外源物质来改良盐渍土对植株造成的伤害,都已成为现阶段防治研究热点。在外源物质防控的研究中,发现外源亚精胺能通过提高多胺含量来减轻盐胁迫对其造成的伤害[6]、钙离子[7]以及外源SA能显著提高盐胁迫下菊花的生长量[8]。一氧化氮(nitricoxide,NO)是植物体内气态活性信号分子,硝普钠(SNP)为常见的供体,能够广泛参与植物的生长发育。同时能够提高植物对干旱[9]、低温[10]、高温[11]、镉胁迫[12]、盐胁迫[13]等环境胁迫的耐受性。通过调节相应的生理代谢过程来促进逆境中植株的种子萌发生长以及光形态建成,促进呼吸作用调节气孔关闭。外源NO在植株的耐盐性上有较深的研究,适当浓度的外源NO供体硝普钠能够有效地缓解盐胁迫对番茄[14]、烟草[15]、高粱[16]、玉米[17]、小麦[18,19]等作物的伤害,而其对菊花的研究鲜见报道。为此,该试验以‘神马’切花为材料,通过NaCl来模拟环境中土壤盐渍危害,研究不同浓度外源一氧化氮供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗生长发育的影响,旨在探究外源一氧化氮供体硝普钠对盐胁迫下菊花的缓解效果以及适宜的外源物质浓度,进一步为探究硝普钠对菊花耐盐性的提高提供参考依据。

1、材料与方法

1.1试验材料

供试材料为生产上常用的主栽切花菊品种‘神马’,由许昌华育花卉有限公司提供。试验于2018年4—6月在许昌职业技术学院进行菊花的繁育。

1.2试验方法

前期苗株采取长势良好并一致的嫩梢扦插到营养土中进行培养,营养土基质为泥炭∶珍珠岩∶蛭石=1∶1∶1(v∶v∶v)。待菊花幼苗长至8～10片叶后,将其幼苗根部基质洗净后以定植棉进行固定后转入水培盒中,以Hoagland营养液进行温室培养,保持温室环境温度为(28±2)℃,相对湿度为70%、每天通过注氧机注氧2h,每3d换一次营养液,待缓苗7d后选取长势一致的菊花幼苗进行盐胁迫处理。共设6个处理,每个处理20株幼苗。分别为:对照(Hoagland营养液,CK);S0(Hoagland营养液+150mmol·L-1NaCl溶液);S1(Hoagland营养液+150mmol·L-1NaCl溶液+0.05mmol·L-1SNP溶液);S2(Hoagland营养液+150mmol·L-1NaCl溶液+0.1mmol·L-1SNP溶液);S3(Hoagland营养液+150mmol·L-1NaCl溶液+0.2mmol·L-1SNP溶液);S4(Hoagland营养液+150mmol·L-1NaCl溶液+0.3mmol·L-1SNP溶液)。在盐胁迫处理的第0、2、4、6、8天分别对菊花幼苗叶片进行取样,并进行各项生理指标的测定。为保证试验的合理性,各处理各时期均采取同一叶位的叶片。

1.3项目测定

1.3.1菊花幼苗鲜质量、饱和质量、干质量及相对含水量测定

盐胁迫处理第8天后称量幼苗鲜质量,然后放入清水中浸泡24h充分吸水达到饱和后,测量其饱和质量。再将幼苗放入105℃烘箱杀青30min,于70℃环境中烘干至恒质量后称量其干质量。通过鲜质量、饱和质量和干质量计算叶片的含水量、相对含水量[20]。

含水量(%)=(鲜质量-干质量)/鲜质量×100;相对含水量(%)=(鲜质量-干质量)/(饱和质量-干质量)×100。

1.3.2菊花幼苗叶片抗氧化酶系统活性测定

取相同叶位叶片0.5g,加入预冷的5mLpH7.8的磷酸缓冲液进行冰浴研磨,并冷冻后10000r·min-1离心20min,上清液即酶活性提取液,置于4℃中低温保存。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)按照PINHEIRO等[21]的方法进行测定。

1.3.3菊花幼苗叶片渗透调节物质测定

称取相同叶位叶片0.5g,按照DHINDSA等[22]的方法使用硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定丙二醛(MDA)含量;使用酸性茚三酮比色法[23]测定脯氨酸含量;按照蒽酮比色法[24]测定可溶性糖含量。

1.3.4菊花幼苗叶片相对电导率及光合色素含量测定

以KHLE等[25]的方法,使用雷磁DDS-11A电导率仪测定菊花植株叶片的相对电解质渗透率。首先将0.5g待测叶片加入25mL去离子水浸泡24h,使用电导率仪测定电解质渗透率R1,在沸水浴中煮沸30min并冷却后测定其电解质渗透率R2,叶片相对电解质泄漏率为初始与最终的电导率的百分比。

参照LICHTENTHALER等[26]的方法加以改进,测定叶绿素a和叶绿素b的含量,取相同叶位叶片0.2g,加入10mL80%的丙酮放置黑暗中处理24h后测定其在665、649、470nm的吸光值。

1.3.5菊花幼苗叶片离子测定

取菊花幼苗植株的叶片,经过去离子水冲洗后进行105℃杀青5min,再于70℃烘干至恒质量,取50mg样品进行研磨并放入消煮管中,加入HNO3-HClO4(4∶1)1mL,摇匀、封口后进行消化35min。并用去离子水定容到10mL,摇匀待测。使用电感耦合等离子体发射光谱仪测定样品中的Na+、K+含量[27]。

1.4数据分析

每次测定数据均表示3次重复试验。试验数据采用方差分析(ANOVA)和邓肯多重比较显示处理之间的差异,数字中的不同字母表示P<0.05时的显著差异。所有统计分析均使用SPSS19.0软件进行处理。

2、结果与分析

2.1外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗生物量及相对含水量的影响

由表1可知,盐胁迫下菊花幼苗地上部、地下部的鲜质量和干质量、饱和质量、含水量以及相对含水量呈显著降低的趋势,S0处理分别较CK处理低43.69%、23.00%、41.67%、33.33%、36.28%、0.48%和12.77%。外源施用4种不同浓度的NO供体硝普钠后其生物量、含水量以及相对含水量都较S0处理有一定地提升,但都不及CK处理。其中S2、S3处理在表型指标上表现较好,其中S2处理的7个指标分别较S0处理高44.83%、11.69%、42.86%、33.33%、31.94%、0.19%和11.17%;S3处理的植株的鲜质量、干质量、饱和质量以及相对含水量分别较S0处理高37.93%、15.58%、42.86%、33.33%、26.39%和11.07%,而含水量较S0处理低0.49%,差异均达到显著水平。相对来说S2处理缓解盐胁迫对菊花的损伤更明显。而外源施用0.3mmol·L-1硝普钠的S4处理生物量、含水量及相对含水量与S0差距不显著,这表明在盐胁迫环境下,外源NO供体硝普钠能在一定程度上缓解盐对菊花幼苗的损伤,不同浓度效果不同。盐渍条件下施用不同浓度的硝普钠能显著提高生物量和含水量、相对含水量,但不能完全抵消盐胁迫造成的伤害。

表1盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花生物量及相对含水量的影响

2.2外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗抗氧化酶系统活性的影响

由图1可知,随着盐胁迫处理时间的推移,6个处理的SOD活性都表现出先升高后降低的趋势,在第0天活性普遍最低。S0、S1、S2、S3、S4都表现为处理第4天SOD活性最高。CK处理5个时间段无显著差异。盐胁迫环境下菊花植株的SOD活性较CK活性增加。处理第2天,S1、S2、S3、S4处理的SOD活性无显著性差异,在处理第4天差异逐渐显著,其中S2活性最高。SOD活性在S2处理的5个时间段中分别较S0高1.39%、9.07%、7.57%、9.22%和8.26%;S1处理的5个时间段中分别较S0高1.91%、8.50%、1.11%、3.55%和2.00%;S3处理的5个时间段中分别较S0高0.35%、9.45%、0.55%、7.45%和5.37%。研究表明菊花植株的SOD活性在盐胁迫下能够在一定范围内表现出升高的趋势,但超过一定范围活性则会下降。

图1盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花SOD活性的影响

由图2可知,5个处理的菊花的POD活性都呈现出随着胁迫时间先增加后减小的趋势,S0、S1、S2、S3处理都表现为在第6天POD活性最强,CK和S4处理表现为第8天活性最强。在处理第0天,各处理间就表现出显著的差异,随着时间的推移差异增加。其中CK活性趋于稳定,盐胁迫下S0处理POD活性增强,S1、S2、S3、S4处理的POD活性也显著增加。具体表现为S1较S0活性高0.64%、1.15%、2.77%、3.53%和3.28%;S2在2～8d较S0活性高1.68%、3.94%、3.84%和2.41%;S3在2～8d较S0活性高1.45%、3.77%、4.13%和3.53%。

图2盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花POD活性的影响

由图3可知,在处理第0天,S0处理的CAT活性最高。随着时间的增长,除了CK处理,其它5个处理都表现为CAT活性持续增加。以S2处理增长最快,第2天到第8天其CAT活性较S0处理分别增加了4.17%、8.40%、19.08%和20.18%,是外源SNP处理后CAT活性增长最快的处理。而CK、S0～S4第8天的CAT活性分别较初始第0天高14.96%、14.14%、61.45%、45.42%和43.83%。增长最高的是S1处理,其次是S2处理。该研究表明适量浓度的外源NO供体硝普钠有利于CAT活性的提高,浓度过高的外源物质会降低CAT活性。

图3盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花CAT活性的影响

图4盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花MDA含量的影响

2.3外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗MDA和脯氨酸含量的影响

由图4可知,在处理第0天时丙二醛含量极低,5个处理含量分别为0.044、0.045、0.046、0.049、0.050μmol·g-1。随着盐胁迫的出现及持续破坏,S0、S1、S2、S3、S4处理的MDA含量都不同程度地上升,其中S0处理上升速度最快,在各处理时间内含量最高。而施加外源NO供体硝普钠的S1、S2、S3、S4处理也不断地上升,其中S4和S1处理上升幅度较大,S2和S3处理上升幅度较小。在处理的第2～8天S0处理的MDA含量分别较S2处理高1.63、2.08、2.07、1.79倍;分别较S3处理高1.53、1.76、1.59、1.73倍。

渗透调节物质在植物逆境胁迫中占有重要的位置,脯氨酸是重要的渗透调节物质。由图5可知,CK在0～8d内脯氨酸含量较为稳定。盐胁迫下菊花体内的脯氨酸含量大幅度上升,以S0处理上升幅度最大,其次为S4处理。S2、S3处理第8天的脯氨酸含量也较第0天显著升高,S2处理在5个时间段分别较CK高1.69%、3.66%、17.09%、34.30%和38.53%;S3处理在5个时间段分别较CK高3.77%、6.28%、18.69%、35.67%和42.87%。相对来说S2处理更接近于CK处理。说明在盐胁迫下,外源NO供体硝普钠能够促进菊花叶片中脯氨酸的积累,减少丙二醛的积累。

图5盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花脯氨酸含量的影响

2.4外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗相对电导率的影响

由图6可知,在处理第0天6个处理无显著差异,相对电导率均值为15.06%。整体CK处理变化趋势不明显,趋近于直线。S0、S1、S2、S3、S4处理均不同程度地上升,其中S0处理上升幅度最大,其次是S4、S1、S3、S2。在处理第2～8天,S0处理的相对电导率分别比CK处理高1.18、2.24、3.21、3.84倍;S2处理的相对电导率分别比CK处理高1.06、1.89、2.90、3.51倍。说明盐胁迫下适当浓度的外源硝普钠能够有效地降低相对电导率,减少脂膜透性。

图6盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花相对电导率的影响

2.5外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗光合色素含量的影响

从表2～3可以看出,在处理第0天,各处理之间的叶绿素a、叶绿素b含量以及总量没有明显的差异,8d盐胁迫下S0处理菊花植株叶片的叶绿素a和叶绿素b含量分别为CK处理的70.43%和65.44%。在外源物质硝普钠的处理下显著提高了盐胁迫下菊花幼苗的光合色素水平。其中以叶绿素a为指标测定时,硝普钠浓度为0.1mmol·L-1的S2处理在处理第2～8天均最接近于CK处理,分别是CK的93.14%、96.42%、95.09%、96.06%。其次是S3、S1、S4处理;以叶绿素b为指标测定时,除了第0、4天,其它时间段仍是S2处理最接近CK处理。同样叶绿素总量也表现为S2处理最佳,研究表明在盐环境下0.1mmol·L-1的硝普钠能够提高光合色素的含量。

2.6外源NO供体硝普钠对盐胁迫下菊花幼苗离子含量的影响

盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花幼苗中Na+、K+含量有不同的影响(图7)。其中在正常霍格兰营养液下生长的CK处理钠离子含量较低、钾离子含量较高。而盐胁迫下二者的含量截然相反。NO供体硝普钠的施用能缓解盐胁迫下钠离子的升高以及钾离子的下降。由图7可知,S2和S3处理的Na+、K+含量较接近于CK处理,2个处理的Na+含量分别是S0的55.20%和59.56%。2个处理的K+含量分别是S0的1.24倍和1.07倍。其中S2处理效果更好,该结果与之前的生物量、相对含水量、抗氧化酶活性、相对电导率、丙二醛含量、光合色素含量趋势保持一致。并且在通过计算整体的钾钠比后发现,盐胁迫下比值显著下降,是CK的3.48%。加入不同浓度的外源硝普钠后,各处理的钾钠比有所上升,S2处理比值最高为55.88%。表明NO供体SNP的施用能够减轻盐对菊花幼苗的毒害。

表2盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花叶绿素a含量的影响

表3盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花叶绿素b含量的影响

图7盐胁迫下不同浓度硝普钠对菊花Na+、K+含量的影响

3、讨论

盐胁迫对植株造成的损伤是复杂的,大量的研究发现[28,29],主要是通过以下3点来损害植株细胞:离子毒害、活性氧积累和生理代谢受阻。钠离子过高会使活性氧代谢平衡被打破以至于积累过量的活性氧,并且也能够使植株体内钙钾元素含量有所下降,离子元素的平衡也被打破,最终导致质膜透性和细胞膜完整性被破坏。此外活性氧的氧化损伤直接会导致光合色素的降解。一旦细胞膜发生破坏透性增大,植株体内必然会积累大量的丙二醛以使电解质渗漏,相对电导率上升。最终会使植株细胞无法完成正常的代谢过程,导致植株生长受损甚至死亡。

郭春晓等[30]研究表明,NaCl胁迫下菊花叶片离子含量会发生显著变化,主要表现为钠离子上升显著,钾离子含量降低,光合作用中净光合速率显著降低。

而硝普钠是重要的一氧化氮供体,NO作为新型气体分子在缓解植物生物与非生物胁迫上有诸多的研究。阮海华[31]研究发现外源NO供体硝普钠处理盐胁迫下的小麦幼苗,能够有效地促进其生殖生长以及延缓衰老。也能够通过缓解盐胁迫对紫花苜蓿造成的氧化损伤,降低O⋅¯2的产生速率,诱导抗氧化酶系统活性的上升,最终提高其生物量[32]。

该研究结果表明,盐胁迫下菊花幼苗植株的生物量和相对含水量显著下降,与S0相比加入不同浓度的外源NO供体硝普钠后的各处理生物量、含水量以及相对含水量都有一定程度地提升,其中以浓度为1mmol·L-1的S2处理效果最好,并随着浓度的升高表现出先升高后降低的趋势,说明适量浓度的SNP能够保护盐胁迫下菊花植株的生长。

由于在盐胁迫下渗透势的降低,渗透调节能力的强弱也反映了植株的耐盐性,脯氨酸作为重要的渗透调节物质,其含量的多少直接反映盐胁迫下的植株适应程度。该研究结果表明,盐胁迫下菊花植株脯氨酸的含量大幅度上升,处理8d的含量是CK的2.43倍,在不同浓度的外源物质施加下其浓度相对CK也显著性上升,但远不及S0处理。脯氨酸的变化趋势与苏江硕等[7]、吴佩等[10]在菊花、黄瓜等的研究一致。可能是其含量在一定范围内能够有效地体现渗透调节的能力,一旦超过某个值其渗透调节能力会出现失衡的情况。

相对电导率体现了细胞膜的完整性,其值越高说明细胞被破坏的程度越高,MDA含量高低也代表着植物耐胁迫的弱强程度。抗氧化酶活性在一定程度上可控制由盐胁迫导致的活性氧过高的情况。在该试验中,盐处理下菊花的相对电导率、MDA含量升高,抗氧化酶活性也相应升高,而外源施用SNP相对盐胁迫处理来说能降低相对电导率、MDA含量以及加速抗氧化酶的活性,而由于CK处理的细胞未受到破坏,这三者指标没有较大的变化。叶绿体在盐胁迫下较容易被破坏,叶绿素a、叶绿素b的含量也代表着植株的损伤程度。该研究结果表明盐胁迫下菊花幼苗叶片叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总量均显著降低,施加SNP随着其浓度的增加表现出使光合色素先升高后降低的趋势。说明外源NO供体硝普钠能够通过提高盐胁迫下光合色素含量、抗氧化酶活性、脯氨酸含量以及降低相对电导率、丙二醛含量来影响菊花幼苗的生长发育,从而增强其耐盐性。

该研究结果显示,在处理的0～8d,外源NO供体SNP浓度呈现低促高抑的效果,以外源施用0.1mmol·L-1SNP溶液的S2处理时各指标表现较好,能够提高盐胁迫下菊花植株的耐盐性。表明适宜的外源硝普钠浓度能够通过提高植株的抗氧化酶系统活性等减少活性氧的产生,从而降低相对电导率、丙二醛含量来维持菊花对盐胁迫的耐受性,最终达到离子平衡生长量提升的效果。

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基金:河南省科技兴林资助项目(豫财农[2014]86号文)