摘要:为探究秋水仙素处理对蝴蝶兰染色体加倍的效果,本研究以蝴蝶兰杂交组合H-03(2n=2x=38)的原球茎为材料,采用共培法诱导多倍体,秋水仙素浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%,处理时间分别为5、10、15d。结果表明,0.05%浓度的秋水仙素处理15d效果最佳,变异率为50.00%,变异株存活率为30.00%;对处理后的植株进行流式细胞仪鉴定和染色体压片分析,发现变异株存在大量嵌合体;与对照相比,变异株形态特征表现为植株矮化、叶色加深、叶片表面粗糙、叶片变大、叶片偏短或偏圆等,部分植株表现出植株畸形或叶片扭曲;气孔观测结果表明,变异株气孔偏圆,单位面积气孔数减少,气孔增大,长、宽较对照分别增长76.45%、38.99%。本研究结果为蝴蝶兰体细胞无性系变异新品种的培育提供了参考。
蝴蝶兰为兰科蝴蝶兰属(Phalaenopsis)植物,其花形似蝴蝶,有“兰花皇后”的美誉。在国内外花卉市场中,蝴蝶兰因其花大色艳备受欢迎,因此培育具有大花性状的蝴蝶兰新种质对于蝴蝶兰育种具有重要作用。目前栽培种主要为四倍体、三倍体和非整倍体,其中四倍体占绝大多数,达82%。多倍体常具有株型粗壮、叶和花器官巨大、抗逆性强等优点[6],因此多倍体诱导是培育蝴蝶兰新品种的一项重要技术。目前,石斛兰、蝴蝶兰、大花蕙兰等热带兰及春兰、蕙兰等地生兰的组织培养技术已较为成熟,常采用组织培养技术结合染色体加倍的方式进行多倍体诱导,也称离体加倍诱导[8]。兰花的多倍体育种在石斛兰、蝴蝶兰、大花蕙兰、等热带兰中的研究较多,离体加倍常以种子、原球茎、丛生芽、茎段、嫩叶等分裂旺盛的器官为诱导材料,以秋水仙素、氨磺灵等为诱导试剂,采用浸泡法、共培法、点滴法等方式诱导多倍体植株。研究表明,相比其他外植体,原球茎具有更高的繁殖系数,可快速增殖,获得大量植株,因此在离体加倍中大多选择原球茎为诱导材料。在蝴蝶兰原球茎多倍体诱导研究中,崔广荣等采用浸泡法比较了秋水仙素不同浓度及时间处理对原球茎加倍的效果;Putri等采用了50mg·L-1秋水仙素处理浸泡10d比较了不同培养基对原球茎诱导的影响;相比浸泡法,秋水仙素共培法具有污染率低、对原球茎伤害较小的优点[32],Grlesbach]采用秋水仙素共培法诱导蝴蝶兰原球茎加倍,在浓度为0.5mg·L-1的固体培养基培养10d能够得到多倍体植株,但获得的多倍体较少,因此应探索秋水仙素共培法的最佳处理条件,以获得更多的多倍体植株。针对目前蝴蝶兰染色体加倍技术不稳定以及加倍率较低的问题,本试验采用不同浓度秋水仙素对蝴蝶兰原球茎进行共培法加倍处理不同时间,以探讨秋水仙素诱导原球茎加倍的适宜条件,旨在为蝴蝶兰多倍体诱导技术的改进以培育花大色艳、观赏价值高的蝴蝶兰新种质提供技术支撑。
1、材料与方法
1.1试验材料
试验材料为2019年通过杂交获得的蝴蝶兰杂交后代种子群体H-03,以无菌播种30d萌发形成的原球茎为材料进行染色体加倍处理。试验在中国农业科学院蔬菜花卉研究所进行,母本1462和父本1411种植于温室,表型性状详见表1。
1.2方法
1.2.1多倍体诱导
将种子置于1/2MS+5.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖+100g·L-1椰汁的培养基上培养形成原球茎,然后将原球茎转接至质量比为0.05%、0.1%、0.2%秋水仙素的1/2MS+1.0mg·L-16-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)+0.2mg·L-1萘乙酸(1-naphthylaceticacid,NAA)+5.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖的固体培养基中,分别处理5、10、15d。以不加秋水仙素的相同培养基为对照,共10个处理,每个处理重复5次。秋水仙素处理后用无菌水冲洗3~4次,滤纸吸干水分,转接至1/2MS+5.0g·L-1琼脂+20g·L-1蔗糖的培养基上,存活植株继代培养2~3次,并计算存活率。培养条件:光照强度2000lx,每日光照时间12~14h,温度25±2℃,pH值5.8。
1.2.2形态学观察
当植株分化成苗且具有4片完全展开叶时,选取对照株和鉴定为加倍的变异株,各选择15株对植株长势、叶片大小、叶片颜色等进行观察记录并对植株株高、叶片长宽等进行测量比较。
1.2.3气孔鉴定
由于染色体加倍植株与未加倍植株的气孔大小通常存在差异,因此气孔大小变化可作为加倍植株的初步鉴定指标。采用程强强的指甲油涂抹技术测定法,取加倍和未加倍植株各10株相同部位的叶片,在叶片下表皮涂抹一层无色透明指甲油(STEPinSTYLECOLOR俄罗斯田园猫Step指甲油,广州时戈服饰有限公司),指甲油干后,用镊子撕取叶片下表皮,平铺在载玻片上,盖上盖玻片压平,在Leica倒置显微镜(北京东方澳洲科技发展有限公司)下观察并拍照。在10×10倍的显微镜下随机选择6个气孔分布均匀的视野,观测单位面积内的气孔数量,并用CameraMeasure随机测量10×40倍显微镜下30个气孔长度和宽度。
1.2.4流式细胞仪倍性分析
采用SysmexCyStainUVPreciseP试剂盒(北京德世达科技有限公司),以蝴蝶兰H-03未进行加倍处理的植株为对照,对秋水仙素处理后植株进行倍性测定。取待测植株新鲜叶片0.5cm2置于培养皿中,取400μLCystainUVPrecisePNucleiExtractionBuffer萃取液滴加在叶片上,用刀片将叶片按横纵向充分切碎。2min后将切碎的悬浮液用50μm微孔滤膜过滤到样品管中,再加入1600μLCystainUVPrecisePStainingBuffer染液,避光染色2min后用CY-S-3039流式细胞仪(德国Partec公司)进行分析,每个样品重复2次,并以流式细胞仪倍性分析结果为标椎,统计变异株数量,计算变异率。
1.2.5染色体压片分析
参考周建金等、庄东红等的压片方法,待试管苗根尖长至1~2cm时,于上午9:00-11:00取试管苗根尖并用刀片去掉表皮(小于1cm)。根尖用0.002mol·L-1浓度的8-羟基喹啉预处理7~8h,蒸馏水洗净后用新配置的卡诺氏固定液(无水乙醇∶冰乙酸=3∶1)固定24h,处理后保存在70%乙醇中。取已处理好的材料,蒸馏水洗2~3次,1mol·L-1盐酸常温处理5~6min,再用1mol·L-1盐酸60℃恒温水浴处理7~8min,用蒸馏水洗2~3次后,在蒸馏水中浸泡2~3h。取处理后根尖置于载玻片上,用刀片切碎,改良苯酚品红染液染色10min后,压片后迅速经过火焰6~7次,用带有橡皮的铅笔轻敲,使染色体分布均匀。在OLYMPUSDP73显微镜(北京东方澳洲科技发展有限公司)下观察,选择染色体分散较好的细胞进行拍照,统计染色体数目,对照株和变异株各统计10个区域以确定染色体数目。
1.2.6数据统计
采用Excel2016进行数据分析,SPSS2.0进行方差分析,采用LSD多重比较方法,表中数据均以均值±标准差表示。
2、结果与分析
2.1不同秋水仙素处理对原球茎存活率的影响
不同秋水仙素浓度和处理时间对蝴蝶兰H-03原球茎的存活率影响较大。如图1所示,处理时间相同时,随着秋水仙素浓度升高,原球茎存活率逐渐下降;处理浓度相同时,随着处理时间延长,原球茎存活率也呈下降趋势。0.05%秋水仙素共培处理对原球茎的伤害相对较小,存活率分别为64.71%、34.78%、30.00%;0.20%秋水仙素共培处理对原球茎伤害较大,存活率分别为14.29%、9.52%、5.94%。
2.2秋水仙素处理对植株形态的影响
秋水仙素处理后变异株与对照株表现出明显差异(表2和图2),主要表现出植株矮化、叶色深绿、叶片表面粗糙、叶片变宽等性状(图2-B),部分植株还表现出畸形、叶片扭曲等现象(图2-C)。由表2可知,对照株与变异株的叶片长宽比分别为3.61、1.43,对照植株叶片狭长,与亲本相似呈现椭圆形,大部分变异株系叶片伸长受到抑制,叶片变短,少数变异株新叶偏圆(图2-D)。叶片数在变异株与对照株之间无显著差异,但株高、叶长、长宽比等指标与对照株相比有降低趋势,分别降低了47.90%、40.71%、60.39%,叶宽升高了50.00%。
2.3变异株系气孔形态观察
由表3可以计算得到对照株与变异株气孔长宽比分别为0.72和0.91,对照株气孔为长圆形,变异株为近圆形。由图3和表3结果可知,变异株的气孔长度、宽度与对照株相比均显著升高,单位面积内气孔数降低,气孔长、宽和长宽比分别升高76.45%、38.99%和26.39%。
2.4变异株系的倍性鉴定
以对照株为对照,采用流式细胞仪和染色体压片两种方式对诱导后的变异株进行倍性鉴定。经流式细胞仪鉴定可发现未经秋水仙素处理的植株为二倍体(图4-A),秋水仙素共培法处理后能够得到大量的变异株,大部分为嵌合体(图4-B)。此外,由表4可知,当处理时间为5d和10d时,处理时间相同,随着处理浓度的升高,变异率逐渐上升;当处理时间为15d时,随着浓度升高,变异率下降。处理浓度相同时,随着处理时间增加,变异率呈上升趋势,但秋水仙素浓度为0.1%处理15d和浓度为0.2%处理15d时,相比处理10d,变异率分别下降16.37个和14.55个百分点。由图1和表4可知,0.2%秋水仙素处理10d时,变异率最高,为54.55%,但存活率较低,仅为9.52%;0.20%秋水仙素处理5d或者0.05%秋水仙素处理10d,变异率均为50.00%,存活率分别为14.29%和30%。综上所述,0.05%秋水仙素处理15d的诱导效果最好,变异率为50%,存活率为30%。对对照株和经流式细胞仪筛选的变异株根尖染色体压片鉴定后可发现,对照株的细胞染色体数目为2n=2x=38(图4-C),秋水仙素处理后,变异株的染色体数目发生了改变,变异株加倍细胞染色体数目为2n=4x=76(图4-D),大部分的变异株根尖中仍然存在染色体数目为2n=2x=38的未加倍细胞。
3、讨论
植物组织培养与染色体加倍技术相结合具有环境条件易控制、短时间内能获得大量变异植株等优点,且蝴蝶兰组织培养技术相当成熟,因此对蝴蝶兰离体加倍方式进行探索具有重要意义。离体加倍方式主要以秋水仙素处理原球茎、类原球茎诱导加倍效果较好,崔广荣等发现浸泡法诱导蝴蝶兰原球茎加倍的最佳处理为浓度低于0.1%,时间不超过3d。本研究采用共培法发现最佳处理浓度为0.05%,也未超过0.1%;Grlesbach采用0.5mg·L-1的秋水仙素共培法处理10d诱导蝴蝶兰原球茎获得多倍体,Sarinee等采用0.05%秋水仙素共培处理9d诱导原球茎得到了50%的四倍体,本研究中0.05%秋水仙素处理15d、0.2%秋水仙素处理5d和10d均得到了不低于50%的变异株。此外,浓度过高或时间过长都对植株有较大的伤害,极易造成植株死亡和植株畸形等问题。因此适宜的秋水仙素处理浓度和处理时间至关重要。本研究中,当秋水仙素处理浓度为0.1%、0.2%,处理时间为15d时,变异率有所下降,因此采用秋水仙素共培法诱导蝴蝶兰原球茎多倍体时,处理时间以不超过15d、处理浓度不超过0.1%为佳。
蝴蝶兰多倍体在形态特征等方面的变化与前人研究结果基本一致,形态方面均表现出了株高下降、植株粗壮、生长缓慢、叶色深绿、叶片表面粗糙等表型性状。此外,对照植株具有叶片偏狭长,变异株叶片具有偏短或偏圆的特点,其结果与Chung等的研究结果一致;变异株系的气孔特征均表现为气孔增大,单位面积内气孔数减少,此外对照株的气孔接近长圆形,变异株气孔接近圆形,研究结果与唐娅梅等的结果一致。蝴蝶兰多倍体的植株形态、气孔特征有区别于二倍体,因此,植株形态和气孔特征可以作为鉴定蝴蝶兰倍性的间接指标。
共培法诱导多倍体具有诱导率较高且污染率低的优点,但经常伴随着嵌合体的产生。本研究通过比较秋水仙素共培法诱导原球茎多倍体的适宜浓度和时间,获得最佳组合处理并得到了一定数量的变异株,但变异株系多为嵌合体,这样的嵌合体在育种中难以直接利用。本研究结果与杨丽娟的研究结果一致,其采用秋水仙素浸泡法和共培法两种方式诱导大花蕙兰原球茎染色体加倍,结果显示共培法效果较好、污染率低但嵌合体较多,原因可能是秋水仙素与原球茎并未均匀接触。叶绍明在对根状茎变异部位进行切割分离时发现提早分离可有效防止嵌合体的产生,Chen等采用水平切割原球茎结合组培的方式得到了大量的多倍体植株,Grosso等通过流式细胞仪对诱导后的原球茎进行早期筛选的方式获得多倍体。因此,在共培法诱导后,采用切割和流式细胞仪等方式分离嵌合体是获得纯合多倍体植株的重要方式。
4、结论
本研究以蝴蝶兰杂交种子H-03原球茎为材料,采用秋水仙素共培法诱导染色体加倍,并根据诱导后组培苗的形态、气孔特征和流式细胞仪分析、染色体压片结果进行多倍性的鉴定。结果表明,0.05%秋水仙素共培处理15d的综合诱导效果最好,可得到50%的变异株,且变异株形态和气孔特征均发生了明显改变。本试验探究了秋水仙素共培法诱导原球茎多倍体的适宜处理时间和浓度,得到了一定数量的变异株系,为进一步鉴定稳定多倍体株系,培育出观赏价值高的蝴蝶兰新种质提供了技术支撑。
参考文献:
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文章来源:吴婷,朱俊,杨佳慧,葛红,杨树华,赵鑫,于晓南,贾瑞冬.秋水仙素诱导蝴蝶兰原球茎产生多倍体研究[J].核农学报,2021,35(11):2463-2469
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