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Axl、Mer和Gas-6在非小细胞肺癌中的表达及预后意义

2025-03-12 58 上传者：管理员

摘要：目的探讨酪氨酸激酶受体家族成员Axl、Mer及其配体生长停滞特异性蛋白(Gas)-6在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及预后意义。方法收集172例NSCLC和68例癌旁组织蜡块，构建4个组织芯片。采用免疫组化法检测组织中Axl、Mer和Gas-6的表达情况。并分析其表达水平与临床病理特征和患者预后的关系。结果免疫组化结果表明，在NSCLC中，Axl高表达率显著高于癌旁组织(P<0.05),其中Axl在肺腺癌中高表达率显著高于肺鳞癌组织(P<0.05)。Mer在肿瘤细胞阳性表达率仅有9%(16/172),但其在肿瘤间质炎症细胞中阳性表达率高达41.9%(72/172)。主要表达在CD163阳性的M2型巨噬细胞。Gas-6在NSCLC的高表达率显著高于癌旁组织(P<0.05)。Axl和Gas-6的高表达均与淋巴结转移和高级别临床分期有关(P<0.01)。生存分析结果表明，Axl高表达是NSCLC的独立预后风险因素。结论 Axl和Gas-6在NSCLC的侵袭和转移中发挥重要作用，尤其在肺腺癌亚型中作用尤为显著。Axl高表达可以作为NSCLC预后差的判定指标之一。Mer主要在肺癌间质中M2型巨噬细胞表达，可能与肿瘤的免疫逃逸相关。

关键词：
NSCLC
生长停滞特异性蛋白6
酪氨酸激酶受体Axl
酪氨酸激酶受体Mer
非小细胞肺癌
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目前,随着人口老龄化的加剧,癌症的发病率逐年升高｡在恶性肿瘤中,肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首〔1〕｡肺癌中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%~85%,包括鳞癌和腺癌等组织亚型,有75%的NSCLC患者在诊断之初就发生了转移和浸润,平均生存期仅为2年｡虽然目前有多种新的治疗方法引入临床,但NSCLC的5年生存率仅为15%〔2〕｡因此寻找有效的预后预测指标和治疗靶点显得至关重要｡

Axl属于酪氨酸蛋白激酶受体TAM家族,该家族还包括Tyro⁃3和Mer,其中Tyro⁃3存在于神经系统〔3〕,而Mer和Axl广泛存在于上皮､血液等多种组织中｡TAM的配体包括生长停滞特异性蛋白(Gas)⁃6和蛋白S｡其中Gas⁃6可以与3种TAM受体结合,其中与Axl结合能力最强,Mer最弱〔4〕｡TAM受体在多种恶性肿瘤中表达增高,如肝细胞肝癌､胰腺癌､结直肠癌和白血病等,参与恶性肿瘤的浸润､侵袭､血管新生和耐药等分子机制〔5〕｡研究表明TAM受体异常高表达可以促进肿瘤进展,然而在浸润性乳腺癌中Axl和Gas⁃6表达量低,并与其进展无关〔6〕,提示TAM家族在肿瘤中的作用机制复杂,需要进一步研究｡为了揭示TAM家族在NSCLC中的表达情况,并了解其表达的临床预后意义｡本文拟分析Axl､Mer和其配体Gas⁃6在NSCLC中表达水平及其与临床病理特征和预后的关系,探索Axl和Mer是否参与了NSCLC的发病及能否作为NSCLC预后判断指标｡

1、材料与方法

1.1病例来源收集172个NSCLC和68个癌旁正常组织的石蜡标本和临床病理资料,病例均来自2010年1月至2013年3月山西省汾阳医院的住院患者｡患者年龄均大于60岁,平均年龄(65.04±0.33)岁,均进行外科肿瘤切除手术｡两名病理学医师采用双盲法对苏木素⁃伊红(HE)染色的组织切片进行复核,对组织病理特点进行确诊｡临床分组标准如下:组织学分级基于肺癌世界卫生组织(WHO)分级标准;临床分期按照美国癌症联合委员会和国际抗癌联盟TNM分期系统(UICC/AJCCTNMStagingSystem)〔7〕｡本研究通过医院伦理委员会伦理审查｡

1.2组织芯片的构建构建4个组织芯片,每个组织芯片植入120个组织柱,方法如下〔8〕:每个受体蜡块钻取120个阵列(10×12)组成的组织孔,由病理医师根据所有病例的HE染色切片,标记癌组织区域,并在蜡块上定位,随后用0.9mm直径的空心针穿刺供体组织蜡块得到组织柱,种植在受体蜡块中,每个标本穿刺两个组织柱,作为重复,每个蜡块包含有60个病例信息即120个组织柱｡

1.3免疫组织化学抗体来源:Axl兔多克隆抗体､Gas⁃6单克隆抗体(批号A0532､A8545,中国爱博泰克生物科技公司)､Mer单克隆抗体(批号BM4167,中国博士德生物工程公司),一抗稀释浓度分别如下:Axl(1∶150)､Gas⁃6(1∶150)､Mer(1∶200)｡免疫组化方法按照链霉亲和素⁃生物素⁃过氧化物酶复合物(SABC)法试剂盒(DAKO,Carpinte⁃ria,加拿大)步骤进行,首先将组织芯片切片为3μm厚的组织切片,3%过氧化氢室温孵育10min去除内源性过氧化物酶,1%山羊血清孵育清除非特异性染色｡一抗4℃湿盒中孵育过夜｡二抗37℃孵育30min,辣根过氧化物酶复合物孵育20min｡最后二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染｡

免疫组化结果判定采用半定量评分系统进行评估〔9〕,即染色强度和阳性百分比综合评分,例如染色阴性(无着色)=0;弱阳性(黄色)=1,中等阳性(棕黄)=2,强阳性(深棕色)=3;在一个样本中随机选取5个高倍视野,计数阳性细胞率然后按照阳性率进行评分0分(0%),1分(1%~10%),2分(11%~50%),3分(51%~80%)和4分(81%~100%)｡将染色强度评分和阳性率评分相乘即得到最后得分,如果分数≥3分为过表达;分数<3分为低表达｡如果分数≥2分为阳性表达;分数<2分为阴性表达｡

1.4随访方法所有的患者在出院第1年每3个月随访1次,随后每年随访1次,随访的终止日期是2021年3月｡总生存期(OS)为从手术时间到患者死亡的时间;患者由于其他原因死亡定为删失数据｡无病生存期(DFS)为手术之日到复发的时间｡

1.5统计学处理采用SPSS22.0软件进行χ2检验､Spearman相关分析;生存曲线用Kaplan⁃Meier法绘制,组间生存时间比较采用Log⁃rank秩和检验,多变量生存分析采用Cox回归模型｡

2、结果

2.1Axl､Mer及其配体Gas⁃6在172例NSCLC患者中的表达由图1可见,Axl和Gas⁃6主要表达在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质｡NSCLC患者中Gas⁃6高表达率为48.8%(84/172),Axl高表达率是38.4%(66/172);癌旁对照组织中Axl和Gas⁃6的高表达率仅为3%(2/68)和5%(3/68)｡Axl和Gas⁃6蛋白在NSCLC中的高表达率明显高于癌旁组织(χ2=30.128､41.620,均P<0.01)｡

由图1可见,Mer表达在肿瘤细胞胞质和胞膜,但其在肿瘤细胞中的阳性表达率仅为9%(16/172);由图2可见,Mer同时也表达在肿瘤间质的炎症细胞胞质中,这些细胞多同时表达CD163,Mer在肿瘤间质中的阳性表达率是41.9%(72/172),癌旁对照组织中Mer的阳性表达率仅为3%(2/68),其阳性表达率显著高于对照组(χ2=34.613,P=0.001)｡

2.2Axl､Mer和Gas⁃6的表达与肿瘤临床病理特点的关系不同临床特征患者Mer阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05)｡在晚期NSCLC患者中Axl高表达率显著高于早期患者(P<0.05),淋巴结转移患者肿瘤组织中Axl高表达率显著高于无淋巴结转移者(P<0.05),腺癌患者Axl高表达率显著高于鳞癌(P<0.05),Axl高表达与性别､吸烟､肿瘤直径及组织学分级无关(P>0.05)｡Gas⁃6高表达率在Ⅲ~Ⅳ期患者中显著高于Ⅰ~Ⅱ期(P<0.01);淋巴结转移患者Gas⁃6高表达率显著高于无转移者(P<0.01);Gas⁃6高表达与性别､吸烟､肿瘤直径和组织分级无关(P>0.05)｡见表1｡对Axl和Gas⁃6高表达率进行相关分析,结果表明二者存在正相关(r=0.289),提示二者可能共同参与了NSCLC的发生机制｡

图1Axl､Mer和Gas⁃6在肺鳞癌和肺腺癌中阳性表达(IHC,×400)

2.3Gas⁃6､Axl和Mer蛋白表达的预后意义从表1､表2､图3可见,采用Log⁃rank检验对NSCLC患者中不同组别的OS进行比较,结果表明淋巴结转移､临床分期､Axl和Gas⁃6表达与OS相关,其中Axl高表达患者OS显著短于Axl低表达显著(P<0.01)｡Gas⁃6高表达的患者OS明显低于Gas⁃6低表达患者(P<0.05),提示Axl和Gas⁃6高表达均与患者预后不良相关｡Mer在肿瘤细胞中阳性表达的患者OS显著短于Mer阴性表达的患者(P<0.05);另外肿瘤间质Mer表达与患者DFS相关,间质Mer阳性表达的患者DFS显著短于阴性(P<0.05)｡除此之外临床分期和淋巴结转移也与DFS有关｡见表1､图3｡进一步采用多变量Cox回归模型进行分析,结果表明仅Axl的高表达和淋巴结转移是NSCLC的独立危险因素｡见表3｡

表1172例NSCLC患者中Axl､Gas⁃6高表达和Mer蛋白阳性表达与临床病理特征的关系及生存分析〔n(%)〕

表2Axl､Gas⁃6高表达及肿瘤细胞(tMer)､间质炎细胞Mer(sMer)表达NSCLC患者生存分析(x±s)

图3不同Axl､Mer和Gas⁃6表达NSCLC患者生存曲线

表3NSCLC患者预后的多因素生存分析

3、讨论

Axl是1988年从人慢性粒细胞白血病中分离出来的原癌基因,可以表达在人慢性粒细胞白血病细胞及多种器官和细胞表面｡Mer最先来源于B淋巴母细胞表面,结构与Axl相似,有44%的序列一致性和相似的结构域〔10〕｡二者同属于酪氨酸激酶受体TAM家族,与配体结合发挥着信号转导的作用〔11〕｡有研究表明,Axl和Mer不在组织中同时表达,Mer的表达伴随着Axl的抑制,反之亦然〔12〕｡在本研究中发现Axl在NSCLC细胞中阳性表达率远远高于Mer的阳性表达率,提示在NSCLC肺癌中发挥作用的主要是Axl,而且Axl的高表达与肺癌的临床分期和淋巴结转移密切相关,Axl参与了NSCLC的浸润和进展｡该研究结果与前期研究结果一致〔13〕｡而且本研究结果提示,Axl主要在肺腺癌中发挥重要作用｡

Gas⁃6是Axl和Mer的一种配体,可以与之结合诱导受体自身磷酸化,启动下游信号通路,从而调控多种细胞功能如肿瘤细胞的增殖､黏附､迁移和转移等〔14〕｡Gas⁃6和Axl在甲状腺癌､乳腺癌､宫颈癌､胃癌等中均存在高表达〔15,16〕｡有研究证明,Gas⁃6与Axl亲和力远远大于其他TAM受体,且体外研究也表明,Gas⁃6的稳定依赖于Axl的表达和激活｡在本研究提示,Axl和其配体Gas⁃6二者可能共同参与了NSCLC的发生机制｡

研究证明,阳性表达的Axl和Gas⁃6在乳腺癌､结直肠癌､卵巢癌､宫颈癌及鼻咽癌中与患者预后相关〔17〕｡本研究中生存分析结果表明Axl高表达可以作为预测NSCLC差预后的生物指标之一｡

除此之外,在本研究中发现Mer虽然在肺癌细胞中表达低,然而在肿瘤间质的炎症细胞中表达率高达41.8%,采用CD163(M2型巨噬细胞特异性标志物之一)〔18〕对这些细胞进行标记,部分细胞阳性｡在三阴乳腺癌的小鼠模型中,研究人员已经发现Mer主要表达在肿瘤微环境中的免疫细胞,而且可以促进肿瘤的进展和转移〔19〕｡本研究提示,NSCLC中Mer可能发挥相似的作用,其阳性细胞部分可能为肿瘤相关巨噬细胞,即M2型巨噬细胞,这些细胞不仅促进肿瘤的浸润,而且与肿瘤的免疫逃逸相关〔20〕｡本研究由于标本数量和蜡块组织的局限性,肿瘤间质中Mer表达细胞在NSCLC细胞的进展中的具体机制仍需进一步研究｡

综上所述,TAM受体Axl及其配体Gas⁃6在NSCLC尤其是腺癌中高表达,会导致NSCLC侵袭性更强,分期更晚,同时导致患者最终生存率降低,预后变差;可以作为NSCLC差预后预测指标之一;Mer主要表达在NSCLC肿瘤间质的M2型巨噬细胞,提示可能与肿瘤免疫逃逸相关,未来有望成为有前景的治疗靶点之一｡

参考文献:

18丁婷婷,泮红飞,张红,等.M2型巨噬细胞标志物CD163与肿瘤的研究进展〔J〕,中国免疫学杂志,2018;34(7):1114⁃7.

基金资助:吕梁市恶性肿瘤研究重点实验室(2020ZDSYS18);吕梁市重点研发项目(2020SHFZ28);

文章来源:赵慧慧,徐义荣,田晓爱,等.Axl､Mer和Gas-6在非小细胞肺癌中的表达及预后意义[J].中国老年学杂志,2025,45(05):1087-1091.