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miR-182通过RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡

2021-12-04 155 上传者：管理员

摘要：目的:检测miR-182在骨肉瘤HOS细胞中的表达,通过构建过表达miR-182的转染载体检测miR-182对骨肉瘤HOS细胞凋亡的影响。方法:RT-qPCR检测骨肉瘤HOS细胞miR-182表达。构建过表达miR-182的转染载体,进行转染后细胞共培养,RT-qPCR检测转染后miR-182表达,显微镜下观察细胞形态。Westernblot分析miR-182对RAC1通路蛋白的作用,CCK-8法分析过表达miR-182对骨肉瘤HOS细胞生长的抑制情况,流式细胞术评估miR-182对骨肉瘤HOS细胞细胞周期及凋亡的影响。结果:骨肉瘤HOS细胞中miR-182呈低表达。构建过表达miR-182的转染载体,骨肉瘤HOS细胞中RAC1通路蛋白及下游PAK1蛋白表达显著下调。过表达miR-182显著促进骨肉瘤细胞凋亡并阻滞其细胞周期进程。结论:miR-182可通过靶向调控RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡并阻止其细胞周期进程。

关键词：
miRNA
RAC1通路
局部复发
细胞凋亡
骨肉瘤
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骨肉瘤是骨骼中最常见肉瘤，恶性程度高，主要影响儿童和青少年，但其发病原因及分子机制尚未阐明。尽管采用手术、新辅助化疗等治疗方案，非转移性骨肉瘤患者预后及生存率显著提高，但仍有约1/3患者出现局部复发，其中转移患者复发率高达1/4[1]。

miRNA是一类具有高度保守性、时序性和特异性的非编码小分子RNA，长度为22～25个核苷酸，miRNA通过与靶基因3'非翻译区（3'UTR）不完全互补配对识别干预靶基因翻译过程[2]。

RAC1、PAK1在多个组织中表达，具有重要细胞功能，如细胞运动、细胞生存、细胞周期、血管生成、基因转录调节及肿瘤发生发展及侵袭转移[3,4]。PAK1为RAC1通路中RAC1蛋白的下游蛋白。RAC1可促进PAK1蛋白活化，进一步激活下游多种信号途径，从而促进肿瘤细胞存活、增殖与迁移，抑制其凋亡，调节细胞骨架动力学和细胞黏附等活动[5]。

miRNA家族重要成员miR-182在肿瘤发展过程中至关重要。研究表明，miR-182在多种肿瘤中，如肺腺癌、乳腺癌和胃肠道肿瘤中可作为抑癌基因抑制肿瘤细胞生长[6,7,8]。但miR-182是否能够通过RAC1通路抑制骨肉瘤生长尚无相关报道，因此，本研究通过检测miR-182在成骨细胞及骨肉瘤中的表达差异，观察miR-182对RAC1通路蛋白的调控作用，从而明确miR-182对骨肉瘤HOS细胞增殖的影响，为骨肉瘤早期诊断、基因治疗提供新的思路，为临床治疗提供理论及实验基础。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞

人骨肉瘤HOS细胞购于中国科学院上海生物科学院细胞资源中心。

1.1.2 试剂

DMEN培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；CCK-8试剂盒购于日本同人化学研究所；RAC1、PAK1抗体购于美国Abcam公司；Lipo‐fectamine3000购于美国Lifecore公司；PCR试剂盒购于日本TaKaRa公司；miR-182mimic、miR-182inhibi‐tor、miR-182NC购于苏州GenePharma公司。

1.2 方法

1.2.1 miRNA-182在骨肉瘤中的表达预测

采用TargetScan(www.targetscan.org）及MiRDB(www.mirdb.org）数据库寻找RAC1蛋白的mRNA序列，预测能够调控RAC1蛋白的潜在miRNA序列及其靶点。

1.2.2 细胞培养

配制骨肉瘤HOS细胞培养基（DMEM+10%FBS+1%青-链霉素混合液）；当细胞生长至70%～80%融合时进行传代，置于37℃、5%CO2培养，传至第三代备用。

1.2.3 细胞转染

选取对数生长期骨肉瘤HOS细胞进行miRNA转染。将miR-mimic、miR-inhibitor和miRNANC相关试剂分别与无血清培养基充分混匀，将Lipofectamine3000加至无血清培养基中充分混匀，将溶解miRNA制剂的溶液同溶解转染试剂的溶液混合后进行细胞共培养，培养6h后更换为新鲜的完全培养基，继续培养用于后续实验。

1.2.4 qPCR检测miRNA-182表达

按照SYBRPremixExTaqTMⅡkit试剂盒说明制备PCR反应液，按照ABI7500PCR仪使用方法进行qPCR反应，计算各组ΔCt值。相关miRNA正义链及反义链由上海吉玛公司设计，miR-182F:5'-TGCGGTTTGGCA-ATGGTAGAAC-3';miR-182R:5'-CCAGTGCAGGG-TCCGAGGT-3';U6F:5'-GCTTCGGCAGCACATATA-CTAAAAT-3';U6R:5'-CGCTTCACGAATTTGCGT‐GTCAT-3'。按照PrimeScriptRT试剂盒说明制备RT反应液（所有操作冰上进行）：5×PrimeScriptBuffer2μl,PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ0.5μl,miRNAprimer0.5μl,Random6mers0.5μl，加RNaseFreeddH2O至10μl。按照SYBRPremixExTaqTMⅡkit试剂盒说明制备PCR反应液（所有操作冰上进行）：2×SYBRPremixExTaqTMⅡ10μl,miR-182forwardprimer(10μmol/L)0.4μl,miR-182reverseprimer(10μmol/L)0.4μl,RT反应液（cDNA)2μl,ddH2O7.2μl。

1.2.5 CCK-8法检测细胞抑制率

分别设置HOS组、miR-182NC组、miR-182mimic组，每组设6个复孔，取对数生长期细胞，在96孔板中均匀接种细胞悬液，37℃、5%CO2孵育24h、48h。加入CCK-8试剂继续孵育2h。将96孔板置于酶标仪中检测吸光度，重复3次，计算细胞抑制率。

1.2.6 Westernblot实验

提取各组总蛋白进行蛋白定量。80V恒压电泳30min，待分离胶和浓缩胶分离后，调整至120V恒压电泳90min，置于转膜槽中转膜（200mA,2h），牛奶封闭2h，蛋白条带放入相应山羊抗兔一抗中4℃孵育过夜，次日取出PVDF膜，放入相应二抗中孵育1h，系统发光成像，计算目的蛋白RAC1、PAK1表达。

1.2.7 细胞处理及凋亡检测

按照上述方法培养细胞及设置分组，培养24h，消化，收集细胞；按照细胞凋亡试剂盒说明操作，流式细胞仪检测。

1.2.8 细胞处理及周期检测

按照上述方法培养细胞及设置分组，培养24h，消化，收集细胞，预冷乙醇过夜固定，次日染色，流式细胞仪检测。

1.3 统计学分析

采用SPSS20.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 Targetscan及miRDB数据库筛选可能靶向RAC1的miRNA序列

通过TargetScan及MiRDB数据库筛选可能靶向RAC1的miRNA的基因序列包含：miR-182、miR-96、miR-101、miR-142、miR-20、miR-365、miR-137（图1）。miR-182可能通过RAC1蛋白影响骨肉瘤HOS细胞生长。

2.2 qPCR检测骨肉瘤HOS细胞miR-182表达

qPCR验证各组细胞中miR-182表达，结果显示，与未转染对照骨肉瘤HOS细胞（2.02±0.11）相比，miR-182NC转染组（阴性对照组）miR-182表达（2.08±0.20）差异无统计学意义，miR-182inhibitor转染组miR-182表达（0.65±0.32）显著降低（P<0.01),miR-182mimic转染组miR-182表达（2.81±0.15）显著升高（P<0.01，图2）。

2.3 CCK-8检测细胞增殖

CCK-8测定24h、48h、72h各组细胞OD值，结果显示，miR-182NC转染组骨肉瘤HOS细胞抑制率差异无统计学意义（图3),miR-182mimic转染组细胞抑制率分别为（34.12±0.20）%、（20.18±0.16）%、（8.25±16.00）%，显著降低，标准曲线见图4。

2.4 Westernblot检测RAC1、PAK1蛋白表达

Westernblot验证各组细胞RAC1、PAK1蛋白表达，结果显示，miR-182NC转染组细胞RAC1及PAK1蛋白表达与未转染HOS组差异无统计学意义（P>0.05），与miR-182mimic转染组细胞RAC1及PAK1蛋白表达差异具有统计学意义（P<0.01，图5）。

2.5 流式细胞术检测骨肉瘤HOS细胞凋亡

流式细胞术检测HOS组、miR-182NC转染组、miR-182mimic转染组细胞凋亡率，结果显示，miR-182NC转染组[（4.93±0.51）%]与未转染骨肉瘤HOS细胞组[（5.58±0.42）%]细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05),miR-182mimic转染组[（22.66±0.42）%]细胞凋亡率显著提高（P<0.01，图6）。

2.6 流式细胞术检测骨肉瘤HOS细胞周期

流式细胞术检测未转染HOS组、miR-182NC转染组、miR-182mimic转染组细胞周期，结果显示，miR-182mimic组HOS细胞G1期占比[（55.26±0.72）%]与HOS组及miR-182NC转染组差异显著（P<0.01),S期占比[（27.37±0.38）%]明显下降（P<0.01),G2期占比[（16.96±0.83）%]有所下降（P<0.05，图7）。

3、讨论

目前骨肉瘤具体发病机制尚不明确，尚无有效治疗方案。近年miRNA在肿瘤中的研究取得重要进展，为肿瘤早期诊断、早期治疗、化疗耐药、远处转移及改善预后等提供了新的思路，但miRNA在骨肉瘤诊断治疗等方面涉及较少，本研究通过探讨miRNA与骨肉瘤细胞的相关性及体外试验，为揭示骨肉瘤发病机制、基因靶向治疗提供实验及理论基础。

miRNA相关拮抗药物或基因模拟药物已被设计用于癌症治疗。单个miRNA同时靶向多个信号通路得到广泛认同，为难治性癌症治疗提供了新的方案。

RAC1信号传导与多种肿瘤细胞生物过程相关，作为一种小的GTP酶，通过调节RAC1能够使肿瘤细胞切换活跃状态和非活跃状态。RAC1激活后，与一系列效应子相互作用，介导肿瘤细胞多种生物学功能[9]。已有实验证实PAK1在多个致癌信号通路中的核心作用，其能够调节肿瘤细胞的可辨识度，并降解肿瘤细胞防御能力，因此作为潜在的肿瘤细胞治疗靶标引起广泛关注[10]。BU等[11]发现PAK1信号传导是RAC1在血管生成中的关键下游介质，抑制RAC1和PAK1蛋白表达可降低肿瘤细胞血管生成能力。同样，XIA等[12]研究发现，抑制RAC1或PAK1可损伤癌细胞血管生成诱导能力。对小G蛋白的研究也逐渐成为肿瘤研究的主要领域。

本研究发现，构建过表达miR-182的细胞可有效抑制PAK1、RAC1蛋白活性，由此推测miR-182表达可介导GTP酶活化，抑制骨肉瘤HOS细胞生长，降低骨肉瘤HOS细胞增殖能力并促进其凋亡，并抑制骨肉瘤HOS生长周期，降低S期比例，使多数细胞停滞于G1期。结合RAC1及PAK1蛋白介导的相关细胞功能，miRNA相关生物制剂或许可通过降低骨肉瘤细胞GTP合成、骨肉瘤细胞血管生成从而降低骨肉瘤细胞活性。

通过构建miRNA相关生物制剂可能影响骨肉瘤早期形成、远期转移及骨肉瘤耐药机制等，从基因层面出发改变肿瘤细胞蛋白功能及RNA翻译转录过程，为精准靶向治疗骨肉瘤开辟新的领域。

文章来源：贵鹏,李朝旭,韩莎,王胜涛,刘继鸿,陈明洲.miR-182通过RAC1通路促进骨肉瘤HOS细胞凋亡[J].中国免疫学杂志,2021,37(23):2861-2864+2870.