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冷冻保存对NK细胞活率及其肿瘤杀伤效果的影响

2021-12-04 51 上传者：管理员

摘要：目的:对比新鲜及冻存复苏的NK细胞的存活率及肿瘤杀伤效果,以便评价冻存的同种异体NK细胞作为即用型产品应用于临床治疗的可行性。方法:利用台盼蓝染色法对冻存前、冻存3个月复苏后及复苏后4℃存放24h时NK细胞进行存活率检测;通过ELISA方法对冻存前后NK细胞IFN-γ表达量检测;利用流式细胞术对其表面活化性受体表达情况进行检测的同时利用RTCAS16系统检测其对A549肿瘤细胞的杀伤作用。结果:冻存复苏后细胞活率为(92.17±1.37)%,复苏后4℃保存24h后仍为(79.97±1.22)%;新鲜NK和冻存NK细胞的IFN-γ分泌量分别为(5967.0±517.8)pg/ml和(4861.0±941.4)pg/ml,二者未见显著性差异(P>0.05),同时,NK细胞冻存后受体NCR2及NKG2D较冻存前均未有明显下降;对A549细胞的杀伤作用中,效靶比(E∶T)为10∶1和5∶1时,冻存复苏NK的杀伤效果与新鲜培养NK细胞无显著性差异,仅在高效靶比(E∶T=20∶1)时冻存NK杀伤作用低于新鲜NK的杀伤作用(P<0.05)。结论:经过对比研究表明,冷冻保存的NK细胞满足临床应用所要求的活率和高效杀伤肿瘤细胞能力,可以发展成为即用型细胞药物,具有广泛的临床应用前景。

关键词：
冻存NK
新鲜NK
细胞活率
肿瘤杀伤活性
自然杀伤细胞
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自然杀伤（NK）细胞是一类重要的淋巴细胞，是人类固有免疫的首道天然防线。由于其具有对异常细胞的杀伤与清除作用，近年来在生物技术和细胞药物研究领域越来越受到重视。NK细胞与T细胞和B细胞的区别在于，其为主要组织相容性复合体（MHC）非限制性免疫类细胞，并且不需要预先致敏即可行使其免疫识别、防疫和维稳等功能[1]。

NK细胞发挥作用主要依靠所分泌的细胞因子及膜受体。O'SULLIVAN等[2]发现，NK细胞对肿瘤杀伤作用依赖于所分泌产生的干扰素γ（interferonγ，IFN-γ）的作用及其对肿瘤微环境中巨噬细胞的激活作用；同时，IFN-γ可以选择性地抑制肿瘤细胞增殖、遏制肿瘤内血管的快速生成[3]。NK细胞的膜受体主要分为抑制性受体和激活性受体两大类，这些受体通过识别自己与非己来调节及平衡细胞毒性作用。激活型受体主要为自然杀伤细胞基团2D(naturalkillercellgroup2D,NKG2D）和自然细胞毒性受体（naturalcytotoxicityreceptors,NCR)[4,5]。研究发现，当肿瘤患者NKG2D表达受到抑制时，NK细胞分泌IFN、激活T细胞并介导细胞毒性作用显著下降[6]。NCR是近10年发现的NK细胞毒性特异性活化受体，包括3种异质性分子：NKp46、NKp44、NKp30，能够辨识病毒硫酸乙酰肝素、凝血素、PC-NA、B7等特定肿瘤抗原，其中NKp44仅表达于活化的NK细胞[4,6]。NCR在辨识和清除靶细胞时，可单独或与其他受体一起作用，例如NK对黑色素瘤杀伤时，NCR发挥主要作用，而NCR表达低下时，NKG2D则会辅助NCR，加强对肿瘤抗原的识别[7,8]。

由于癌症患者自身NK细胞数量的减少及功能异常，使自体NK细胞扩增能力及功能受到限制，因此科学家们致力于同种异体NK细胞的安全性及有效性研究[9,10]。KLINGEMANN等[11]研究表明，同种异体NK细胞在多发性骨髓瘤和淋巴瘤治疗中具有很高的安全性和较好的抗肿瘤活性。HOLUBOVA等[12]研究表明，冷冻保存的NK细胞具有较高的肿瘤杀伤活性。本研究欲在此基础上，通过对生产的新鲜NK细胞与冻存NK细胞活率、因子分泌能力及部分表面活化性受体的变化对比来确定NK细胞冻存前后的差异，同时利用A549细胞对冻存前后NK细胞进行肿瘤杀伤能力检测，为批量扩增并冷冻保存的同种异体NK细胞作为即用型产品而应用于临床提供有力支持。

1、材料与方法

1.1 材料

淋巴细胞分离液Ficoll-PaquePLUS为GE公司产品；4-1BBL、IL-15和IL-21基因修饰的K562滋养细胞由本实验室保存；IL-2购自北京四环制药有限公司；GT-T551H3培养基、2L细胞培养袋均为TaKaRa公司产品；T75、T175细胞培养瓶均为Nest品牌产品；15ml、50ml细胞离心管均为Corning公司产品；CO2细胞培养箱、离心机、酶标仪为美国Thermo公司产品；显微镜为日本Olympus公司产品；KX-21血细胞分析仪为日本SYSMEX公司产品；流式细胞仪为美国BeckmanCoulter公司产品；Rabbitanti-humanNKG2DIgG/FITC、Rabbitanti-humanNCR2IgG/FITC均购自北京博奥森生物科技有限公司；RTCAS16系统为ACEA公司产品；人肺癌细胞A549由ACEA公司赠送；胰蛋白酶、胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）、DMEM培养基均由美国Gibco公司生产；IFN-γELISA试剂盒购自哈尔滨赛莱博科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 新鲜NK细胞及冻存NK细胞解冻后的活率检测

PBMCs分离：根据参考文献[13]进行，将成人外周血2000r/min离心10min后吸出血浆，56℃水浴灭活30min，备用；血细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液的离心管中，2000r/min离心20min密度梯度离心收集白膜层细胞并用生理盐水洗涤2次，计数备用。

NK扩增：根据参考文献[13]进行，用30mlGT-T551H3培养基将2×107～3×107个PBMCs重悬后，接入T75细胞培养瓶，然后加入IL-2、K562滋养细胞及占培养基体积5%的灭活的自体血浆，其中IL-2为500U/ml，滋养细胞为1×106个/ml,37℃、5%CO2条件下体外共培养15d，其中培养第7天时补加1次NK扩增滋养细胞，补加的NK扩增滋养细胞的数量为NK细胞数量的1/4，过程中进行补液，共培养15d。

NK细胞冻存及冻存前后存活率计算：在培养第15天时，取200μlNK细胞，台盼蓝染色后用血细胞计数板进行计数及计算细胞活率，染色后细胞取样计数3次；根据所测得的细胞密度进行细胞冻存，冻存液为：50%GT-T551H3培养基，10%二甲基亚砜（dimethylsulfoxide,DMSO),40%FBS，冻存密度为8×106个/ml。NK细胞冻存3个月后37℃水浴解冻，取2×106个细胞加入1～2ml生理盐水，取200μl进行台盼蓝染色后用血细胞计数板进行计数及计算细胞存活率，染色后细胞取样计数3次；同时取2×106个细胞离心去除冻存液并利用1～2ml生理盐水重悬4℃保存24h后取200μl进行台盼蓝染色后用血细胞计数板进行计数及计算细胞存活率，染色后细胞取样计数3次。

1.2.2 ELISA方法对新鲜及冻存的NK细胞进行IFN-γ分泌能力检测

将新鲜NK细胞用无血清GT-T551H3培养基稀释至1×106个/ml，取2ml接种6孔板，培养48h后1500r/min离心5min收取上清，-80℃冷冻保存；新鲜NK细胞冻存3个月后37℃水浴解冻进行计数，同样将其用无血清GT-T551H3培养基稀释接种6孔板，培养48h后离心收取培养上清，-80℃冷冻保存。

将IFN-γELISA检测试剂盒室温平衡20min后，按照说明书加样要求进行样本加样，最终利用酶标仪检测450nm波长处各孔的OD值，利用标准品绘制标准曲线，从而根据各孔对应OD值计算出相应浓度。

1.2.3 新鲜NK细胞与冻存NK细胞表面活化性受体表达差别分析

取培养第15天的新鲜NK细胞1500r/min离心5min弃上清，用PBS重悬计数后取3×106个/ml制成密度为2×106个/ml的单细胞悬液，并将其平均分成3管，分别加入抗体IgG1-FITC、anti-NKG2D-FITC、anti-NCR2-FITC,4℃避光孵育30min,PBS洗涤细胞2次后进行流式细胞仪检测。取冻存3个月的NK细胞进行37℃水浴解冻，PBS洗涤后制备单细胞悬液并进行流式细胞仪检测，具体方法与新鲜NK细胞的检测方法相同。

1.2.4 新鲜NK细胞与冻存NK细胞的肿瘤的杀伤效果对比研究

实验分组：本研究共分为4组，分别为靶细胞对照组及3个实验组，3个实验组分别为E∶T[E∶T为效靶比，即NK细胞数（效应细胞，E）与肿瘤细胞数（靶细胞，T）的比例]为20∶1组、10∶1组、5∶1组。

实验过程为：肺癌细胞A549经胰蛋白酶消化变圆后，用含10%FBS的DMEM终止后1300r/min离心5min，去除上清，用新鲜培养基稀释计数，最终稀释成1×105个/ml。向E-Plate16PET板每孔中加入50μl培养基，于RTCAS16系统的检测平台上检测基线，保证各孔的CellIndex低于0.063；取出E-Plate16PET并向孔中加入100μlA549细胞悬液，于RTCA检测平台上过夜培养。培养后的细胞分成4组，分别为E∶T=20∶1组、E∶T=10∶1组、E∶T=5∶1组及靶细胞对照组，每组2个平行孔。在肿瘤细胞接种约19h时加入NK细胞。取培养第15天的新鲜NK细胞用肿瘤细胞培养基稀释细胞至4×106个/ml、2×106个/ml、1×106个/ml后，依次加入E∶T=20∶1组、E∶T=10∶1组、E∶T=5∶1组对应孔中，细胞悬液量为50μl，靶细胞对照组中加入50μl培养基，实时观察杀伤效果；NK细胞冻存3个月后，取出于37℃水浴中解冻，进行肿瘤杀伤效果检测，检测方法与新鲜NK细胞的肿瘤杀伤检测方法相同。杀伤率（%）=[1-（效靶细胞作用孔Index值-效应细胞孔Index值）]/靶细胞孔Index值×100%。

1.3 统计学处理

所有实验数据按照显示，通过统计学分析软件SPSS13.0对数据进行独立t检验和统计学意义分析，当P<0.05表示差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 新鲜NK细胞与冻存NK细胞存活率对比分析

本研究中，培养后的NK细胞存活率为（96.43±0.50）%，冻存NK细胞复苏后的活率可达（92.17±1.37）%，复苏后4℃保存24h时活率仍可达（79.97±1.22）%，虽然复苏后及复苏后4℃保存24h时NK细胞活率较冻存前有一定降低，但结果显示所冻存的NK细胞仍可以满足临床要求的80%的细胞存活率，如图1所示。

2.2 新鲜及冻存NK细胞IFN-γ分泌能力检测

利用无血清培养基对新鲜和复苏NK细胞进行培养，细胞密度均为1×106个/ml,24h后利用ELISA方法进行IFN-γ分泌量检测，结果中，新鲜NK的IFN-γ分泌量为（5967.0±517.8)pg/ml，冻存复苏的NK细胞的表达量为（4861.0±941.4)pg/ml，冻存NK细胞IFN-γ分泌能力较新鲜NK细胞有所降低，但未见显著差异（P>0.05），如图2所示。

2.3 新鲜NK细胞与冻存NK细胞表面活化性受体表达差别

由于NK细胞具有表达NCR2和NKG2D的性质，并且NK细胞异体NCR2和NKG2D在识别、杀伤靶细胞中起重要作用，因此对冻存前后的细胞进行该功能验证，流式细胞仪分析结果，如图3所示，冻存复苏的NK细胞与新鲜的NK细胞相比，NCR2未见明显变化，而NKG2D的表达量却有所增加，为新鲜NK的1.87倍。由此可见，冻存后NK细胞NCR2和NKG2D的表达未较冻存前降低。

2.4 新鲜NK细胞与冻存NK细胞的肿瘤的杀伤效果对比研究

A549细胞接种量为10000个/孔，效靶比为20∶1、10∶1、5∶1时观察NK细胞对A549细胞的杀伤效果。结果显示，新鲜NK细胞在曲线上96h时，效靶比为20∶1、10∶1、5∶1的杀伤率分别为：（90.48±1.19）%、（79.16±1.79）%、（59.77±3.34）%；冻存NK细胞在曲线上96h时，效靶比为20∶1、10∶1,5∶1的杀伤率分别为：（78.05±1.13)%,(69.78±1.65）%、（51.21±2.86）%。E∶T=20∶1时，新鲜NK对A549细胞的杀伤作用显著高于冻存NK(t20∶1=7.593,P20∶1=0.0169<0.05);E∶T=10∶1和5∶1时，两组未见显著差异（t10∶1=3.861,P10∶1=0.0610>0.05;t5∶1=1.947,P5∶1=0.1909>0.05），如图4、图5所示。

3、讨论

2009年5月，国家卫生监管部门制定了《自体免疫细胞（T细胞、NK细胞）治疗技术管理规范（征求意见稿）》，规范明确列出了回输时细胞应符合的最低临床标准，包括细胞数量和存活率等指标，其中要求回输时的细胞存活率应大于等于80%。本研究所冻存的NK细胞复苏后活率可达（92.17±1.37）%，复苏后4℃保存24h后活率仍可达（79.97±1.22）%，说明所冻存的NK细胞可以满足临床要求的细胞存活率。

NK细胞活性受细胞膜上两大类受体调控，抑制性受体和激活性受体，其中天然细胞毒性受体（NCR）和NKG2家族的NKG2D均为激活性受体[14]。自体NK回输时，KIR可以识别自体细胞，抑制NK细胞的激活，而异体NK回输时抑制作用较弱，因此异体NK细胞的活化性受体对治疗起重要作用[15]。本研究中，冻存复苏的NK细胞与新鲜的NK细胞相比，冻存后NK细胞NCR2和NKG2D的表达未较冻存前降低，说明冻存复苏过程不会影响NK细胞表面相关活化型受体的表达。

NK细胞具有广谱的肿瘤杀伤效果，杀伤机制包括：FasL与Fas相作用、穿孔素/颗粒酶作用、借助表面CD16与肿瘤特异性IgG发生的抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、肿瘤凋亡相关因子（TNF-α、IFN-γ）的分泌作用[15,16,17]。DOMOGALA等[18]研究发现冻存的脐血CD34阳性细胞分化成NK细胞的能力未受冻存影响，HOLUBOVA等[19]的临床前研究表明，冻存复苏的NK细胞再iL-2激活后能表达NK细胞活化受体NKp44,NKG2D和CD25并对血液肿瘤细胞系K562具有细胞毒性作用。本研究则从人肺癌细胞系A549入手进行创新性研究，本研究发现，NK细胞在冻存后IFN-γ分泌能力较新鲜NK细胞有所降低，但未见显著差异（P>0.05），说明冻存不会对IFN分泌功能产生明显影响，同时，NK细胞的肿瘤的杀伤研究发现，E∶T=10∶1和5∶1时，新鲜与冻存复苏NK对A549细胞的杀伤作用未见显著差异（均为P>0.05）；同时对新鲜和冻存NK细胞在E∶T=20∶1,E∶T=10∶1和E∶T=5∶1这3种效靶比下的杀伤效果进行整体差异性分析，杀伤效果未见显著性差异（P>0.05），因此证明冻存复苏的NK细胞对人肺癌细胞A549杀伤效能与新鲜NK接近。

本研究也发现，当E∶T=20∶1时，新鲜NK对A549细胞的杀伤作用高于冻存NK，具有显著性差异（P<0.05），这可能是NK细胞冻存复苏后部分冻存NK细胞死亡造成其对A549杀伤作用降低。在高效靶比的情况下，累积体现出来，该结果提示，未来在利用冻存复苏的NK细胞进行高效靶比临床肿瘤治疗时，可通过适当增加NK细胞数量，以达到更好的体内与相应新鲜NK细胞近似的肿瘤杀伤效果。本研究首次采用人肺癌细胞A549作为效应细胞，报道了冻存复苏的NK细胞与新鲜培养NK细胞的区别，结果将为冻存的同种异体NK细胞作为即用型产品进行患者治疗提供有力支持。

参考文献:

[1]刘春香,张怡,芦慧颖MK(细胞的高效扩增及其对休外肿瘤模型的杀伤效果研究[J].中国免疫学杂志,2017.33(8)1186-1190.

[14]唐甜,饶巍.自然杀伤细胞抗肿瘤免疫治疗研究进展--从实验室到临床[J].中国肿瘤,2017,26(1)44-52.

文章来源：刘春香,张怡.冷冻保存对NK细胞活率及其肿瘤杀伤效果的影响[J].中国免疫学杂志,2021,37(24):3010-3014.