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ACY-1在儿童神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及其意义

  2021-12-08    202  上传者:管理员

摘要:目的:探究氨基酰化酶-1(ACY-1)在儿童神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及其意义。方法:采用qRT-PCR和Westernblot技术对儿童神经母细胞瘤患者的肿瘤组织和癌旁组织中ACY-1的表达进行检测。然后对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞株)进行体外细胞功能实验,运用重组腺病毒载体转染技术过表达或者抑制ACY-1的表达,采用CCK-8法、流式细胞术和Transwell法检测研究ACY-1对该肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。结果:qRT-PCR和Westernblot实验结果表明,儿童神经母细胞瘤组织中ACY-1的mRNA表达水平和蛋白表达水平均低于癌旁组织。ACY-1过表达不仅可抑制SH-SY5Y细胞株的增殖并诱导其凋亡,而且可抑制其迁移和侵袭;当ACY-1的表达受到抑制时,实验则显示出相反的趋势。结论:ACY-1可能与儿童神经母细胞瘤的发生发展密切相关,它可调节神经母细胞瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭。

  • 关键词:
  • ACY-1
  • 儿童神经母细胞瘤
  • 细胞株增殖
  • 细胞表达
  • 重组腺病毒载体转染技术
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神经母细胞瘤(NB)是常见的儿童期恶性实体肿瘤之一,约占儿童恶性肿瘤的7%,儿童恶性肿瘤死亡的15%来源于该病[1,2]。近年来NB的发病率迅速增加,确诊后儿童的2年生存率仅为38%[3]。NB主要表现为肿块,并出现在交感神经系统组织中[4],恶性程度高,早期容易发生骨髓转移和远处转移,是NB患儿死亡的主要原因。目前NB主要的临床治疗方法有手术、放疗、化疗和免疫疗法[5,6],但治疗效果仍不能令人满意,预后欠佳。因此阐明NB的生长增殖和转移的机制,为采取相应的干预措施来预防或抑制肿瘤提供依据尤为重要。

氨基酸酰化酶1(aminoacylase-1,ACY-1)是一种细胞溶质酶,它能够在蛋白质的氨基酸脱酰过程中起到催化作用,最终能够增强该蛋白质的稳定性[7,8]。研究表明ACY-1在许多肿瘤疾病的发病机理中起着至关重要的作用,如大肠癌、肝癌和小细胞肺癌等[9,10,11]。有文献报道,ACY-1在NB患者的血清中持续低表达,往往预示着患者的预后欠佳[12]。

本研究探讨ACY-1在儿童NB组织中的表达和其对NB细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,旨在研究ACY-1与NB致病机制的相关性,为诊断和治疗提供依据。


1、材料与方法


1.1 组织标本

选取2020年01月到2020年12月期间,8例在我院手术治疗的儿童NB患者,术前均没有接受化疗和放疗处理。其中男5例,女3例;年龄3~13.4岁,中位年龄8.4岁。肿瘤组织样本均来自于手术切除,并采集上述入选者相应的癌旁组织(距离肿瘤组织5cm以上),组织标本离体后立刻存储于-80℃冰箱。样本采集遵循法律和伦理委员会准则,并取得患者知情同意。

1.2 主要仪器与试剂

高速低温离心机(Eppendorf,德国);实时荧光定量PCR仪(ABI,美国);电泳仪(BIO-ARAD,美国),凝胶成像分析仪(BIO-ARAD,美国);流式细胞仪(BD,美国);荧光显微镜(Olympus,日本);CO2细胞培养箱(SANYO,日本);抗ACY-1抗体(abcam,美国);抗GAPDH抗体(abcam,美国);BCA定量试剂盒(Pierce,美国);TaqDNAPolymerase、dNTPMix、GeneRulerTM100bpDNALadder(Fermentas,美国);Trizol试剂盒(Roche,瑞士);Sybrgreen试剂盒(Roche,瑞士);逆转录酶试剂盒(LifeTechnologies,美国);CCK-8试剂盒(Abcam,美国);细胞凋亡检测试剂盒(BD,美国);Transwell小室(Chemicon,美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 引物合成

引物的合成由上海生工生物公司合成。引物序列:ACY-1上游引物为5'-GGCTGCATGAGGCTGTGTT-3',下游引物为5'-CTTGGCACTGGTTGGGATG-3';β-actin为内参,上游引物为5'-TGGCACCCAGCACAATGAA-3',下游引物为5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'。

1.3.2 RNA的提取与反转录

取组织标本50mg,研磨成粉末,Trizol裂解研磨至液体。经氯仿分层、异丙醇沉淀及75%乙醇溶液洗涤干燥后,DEPC水溶解RNA沉淀。取1μL溶液用超微量分光光度计测RNA浓度及纯度。然后按照试剂盒的操作步骤进行反转录。反转录产物置于-20℃保存。同法运用于SH-SY5Y细胞株中。

1.3.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测组织和细胞中的ACY-1mRNA水平

采用SYBRGreenqPCR进行检测,β-actin为内参。反应体系为20μL:SYBRPremixExTaq(2×)10μL,PCRForwardPrimer(10μmol/L)0.8μL,PCRReversePrimer(10μmol/L)0.8μL,DNA模板2μL,ddH2O6.4μL。反应设3个复孔。反应条件:预变性95℃30s;PCR95℃5s,60℃30s,45个循环;溶解95℃5s,60℃1s;降温50℃30s。利用2-△△Ct法计算分析ACY-1mRNA相对表达量。

1.3.4 蛋白提取和蛋白浓度测定

取50mg组织样本,研磨后加入RIPA裂解缓冲液超声破碎处理。加入等体积的0.2%SDS,4℃12000r/min离心1h,收集上清并分装后于-80℃保存。利用BCAProteinAssayKit测定蛋白浓度,使用酶标仪测定562nm处吸光度(absorbancy,A)值,根据标准曲线计算蛋白浓度。同法运用于SH-SY5Y细胞株中。

1.3.5 蛋白免疫印迹实验(Westernblot)检测组织和细胞中的ACY-1蛋白水平

配制分离胶和浓缩胶,加电泳缓冲液后上样,电泳后将蛋白转印于NC膜。3%脱脂奶粉封闭后加入一抗:ACY-1抗体和内参GAPDH抗体;4℃过夜后洗膜,加入二抗37℃孵育1h。洗膜后使用增强化学发光系统对样品进行可视化处理,并使用ImageJ软件对条带测量灰度值做统计分析。

1.3.6 细胞株培养

人NB细胞株SH-SY5Y细胞购买自美国ATCC公司。细胞在RPMI1640培养基中培养,并放在37℃、5%CO2的潮湿培养箱中孵育。

1.3.7 ACY-1的抑制和过表达质粒构建

分别将含有siRNA-ACY-1、siRNA-scramble(空白干扰)的片段、含ACY-1片段或空载体的腺病毒载体转染到SH-SY5Y细胞培养48h。细胞实验分成五组:Control组(空白对照组)、Mock组(过表达对照组)、ACY-1组(过表达组)、si-ACY-1组(低表达组)、si-scramble组(低表达对照组)。通过荧光显微镜、qRT-PCR和Westernblot测定ACY-1在SH-SY5Y细胞中的表达,并评估转染效率。

1.3.8 CCK-8法测定细胞增殖情况

上述处理的SH-SY5Y细胞,在96孔板中培养24h后,用微孔板读数器测定光密度。

1.3.9 流式细胞术检测细胞凋亡

将细胞接种到6孔板上,培养24h后用PBS洗涤,在黑暗中用膜联蛋白V孵育10min,清洗后用碘化丙啶染色,采用流式细胞仪检测。

1.3.10 Transwell试验检测细胞迁移和侵袭能力

将SH-SY5Y细胞接种到涂有或不涂有基质凝胶的上室,将添加有10%胎牛血清的RPMI1640培养基作为化学引诱剂添加到下室。细胞孵育后在显微镜下计数。

1.4 统计学方法

采用SPSS20.0统计软件分析处理数据,各组实验数据(重复5次)以(x¯±s)记录,并采用Graphpadprism8.0软件绘图。采用单因素方差分析比较不同组之间的差异,P<0.05为差异有统计学意义。


2、结果


2.1 ACY-1mRNA和蛋白在儿童NB组织中的表达

qRT-PCR检测8对儿童NB肿瘤组织及其配对癌旁组织中ACY-1mRNA的表达水平,结果显示儿童NB组织中ACY-1mRNA的表达水平明显低于癌旁组织(图1A)。同时Westernblot检测两组样本组织中ACY-1的蛋白表达水平,也得到相同的趋势(图1B-C)。

2.2 ACY-1在人NB细胞(SH-SY5Y)中的转染效率

荧光显微镜显示,含有ACY-1片段的腺病毒载体转染到SH-SY5Y细胞后,ACY-1表达水平升高,而siRNA-ACY-1片段转染则降低了ACY-1在细胞中的表达(图2A)。qRT-PCR和Westernblot实验也显示出相似的趋势(图2B-D)。提示SH-SY5Y细胞ACY-1抑制和过表达质粒构建成功。

2.3 ACY-1影响人NB细胞(SH-SY5Y)的增殖和凋亡

细胞增殖试验(CCK-8法)显示,与Mock组比较,SH-SY5Y细胞在过表达ACY-1后的24、48、72和96h均存在着细胞增殖受到抑制的情况;而与si-scramble组比较,抑制ACY-1后则促进了细胞的增殖(图3)。表明ACY-1能抑制SH-SY5Y细胞的增殖过程。

流式细胞术分析显示,与Mock组比较,ACY-1过表达显著促进了SH-SY5Y细胞的凋亡;而与si-scramble组比较,抑制ACY-1显著抑制了细胞的凋亡(图4)。表明ACY-1能促进SH-SY5Y细胞的凋亡过程。

2.4 ACY-1调节人NB细胞(SH-SY5Y)的迁移和侵袭能力

Transwell实验结果显示,与Mock组比较,ACY-1在SH-SY5Y细胞中的过表达抑制了细胞的迁移和侵袭能力,而细胞的迁移和侵袭能力在si-ACY-1组(抑制组)得到了提升(图5)。这些结果表明,ACY-1抑制了SH-SY5Y细胞的迁移和侵袭。


3、讨论


NB是儿童时期较为常见的一种起源于交感神经系统的恶性胚源性肿瘤。其发生部位较广,临床表现多样,总体恶性程度较高,很容易早期发生转移,发病率和死亡率较高[13]。因此阐明其肿瘤发生及转移的分子机制和寻找新的治疗方法就显得尤为重要[14]。

ACY-1能够使细胞内蛋白的N末端肽链上的α酰化氨基酸发生乙酰化,在此过程之后能够使该蛋白质的稳定性增强[15]。许多研究表明,ACY-1在肿瘤发展过程中起着关键作用[16,17]。本研究中,我们通过qRT-PCR和Westernblot法分别检测儿童NB患者肿瘤组织及其癌旁组织中ACY-1mRNA和蛋白的表达情况,结果显示肿瘤组织中ACY-1mRNA和ACY-1蛋白的表达水平明显低于癌旁组织。上述结果与ACY-1在结直肠癌中的报道恰好相反[18],而与小细胞肺癌和肝癌中的报道相一致[11,19]。这提示ACY-1在儿童NB的发生发展过程中有可能起到了类似抑癌基因的作用,它的减少可能导致细胞的不稳定状态,从而引发组织的癌变。ACY-1的缺失可能参与了儿童NB的发生发展并且起到了促进作用。

本研究深入进行了体外细胞功能实验,在人NB细胞即SH-SY5Y细胞株中利用重组腺病毒载体细胞转染技术分别过表达和抑制ACY-1,观察体外状态下其对SH-SY5Y细胞株增殖、调亡、迁移和侵袭的影响。实验结果表明,ACY-1的过表达可以抑制SH-SY5Y细胞的增殖,促进细胞的凋亡,并抑制了细胞的迁移和侵袭能力,然而当ACY-1被抑制后则显示出完全相反的趋势结果。上述结果提示,ACY-1的表达与该肿瘤细胞的增殖生长和迁移侵袭呈负相关趋势。众所周知细胞增殖是指细胞生长和分裂导致的细胞数量增加,这是正常组织生长和异常肿瘤发生所必需的[20]。从胚胎发育到衰老,细胞增殖和凋亡由细胞信号的严格协调来维持,细胞增殖和凋亡的失控是所有肿瘤发生发展的必然特征[21]。此外,肿瘤细胞的迁移与侵袭能力亦为肿瘤生物学活性的重要特点,它能影响肿瘤的恶性程度,并直接影响疾病的整体预后[22]。ACY-1在NB细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等过程中起了极其重要的作用,它影响了NB的发生发展。

总之,ACY-1在儿童NB组织中是呈低表达状态存在的,可能是NB的致病因素之一。它影响了NB细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭过程。目前我们的研究尚处于起步阶段,仍需要日后对其具体机制进行深入的实验与探索。


参考文献:

[14]杨深,王焕民.神经母细胞瘤相关分子生物学机制研究进展[J].中华实用儿科临床杂志,2017,32(23)1836-1840.

[18]郭魁元,罗昭峰,郭晓磊,等.沉默ACY-1基因表达对结直肠癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响[J].现代肿瘤医学,2018,26(19)42-46.

[19]黄驿胜,王竞枫,林枫,等.氢基酰化酶-1在肝癌组织中的表达及其临床意义[J]实用医药杂志,2018,35(3)197-200.

[22]黄程,马晓莉.神经母细胞瘤生物学特征及其预后因素的研究进展[U].中华实用儿科临床杂志,2016,31(3):235-237.


文章来源:陈子民,孙俊,高家辉,吴宙光,张晓雯,王子涵.ACY-1在儿童神经母细胞瘤组织和细胞中的表达及其意义[J].现代肿瘤医学,2022,30(01):11-15.

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