舌鳞状细胞癌(TSCC)是口腔鳞状细胞癌的主要类型，占口腔鳞状细胞癌的25%～40%[1]。TSCC的发生与生活方式有关，过量吸烟和饮酒、不规则饮食、病毒感染均是导致TSCC发生的危险因素[2]。尽管肿瘤的预防和治疗已取得较大进展，但TSCC患者存活率仍较低[3]。奥沙利铂(L-OHP)是临床治疗口腔鳞状细胞癌的常用药物，但固有或后天耐药严重限制了L-OHP的治疗效果[4]。因此，探讨新的治疗靶点以改善L-OHP的疗效对口腔鳞状细胞癌的治疗有重要意义。miR-135a-5p可作为肿瘤治疗靶点和诊断生物标志物[5]。B淋巴瘤莫洛尼鼠白血病病毒插入区1(BMI1)与多种肿瘤的发生、发展及耐药有关，其表达受miRNA调控[6]。miR-135a-5p与BMI1在TSCC中的作用目前尚不清楚。本研究探讨miR-135a-5p和BMI1对TSCC细胞L-OHP敏感性的影响及其在TSCC细胞中的作用机制，报道如下。

1、材料与方法

1.1 一般材料

正常人口腔角质形成细胞(humanoralkeratinocyte,HOK)和TSCC细胞系CAL-27、SCC9、SCC25细胞购自中国科学院上海细胞库。将冻存的HOK、CAL-27、SCC9和SCC25细胞自液氮罐中取出后置于37℃温水中快速解冻。离心收集细胞，加入含体积分数10%FBS的RPIM-1640培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至培养皿中，轻晃培养皿，使细胞均匀分布。细胞置于37℃、体积分数5%CO2培养箱内继续培养。收集对数生长期的HOK、CAL-27、SCC9和SCC25细胞，进行后续实验。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂

L-OHP(美国Sigma-Aldrich公司),LipofectamineTM2000(美国ThermoFisherScientific公司),miRNA阴性对照(miR-NC)、过表达载体阴性对照(pcDNA-NC)、miR-135a-5p模拟物、BMI1过表达载体(pcDNA-BMI1)、BMI1野生型(BMI1-WT)报告基因质粒、BMI1突变型(BMI1-MUT)报告基因质粒(广州复能基因有限公司),荧光素酶报告基因检测试剂盒[翌圣生物科技(上海)有限公司],CCK-8试剂盒(武汉菲恩生物科技有限公司),SYBRPremixExTaqTMⅡ试剂盒(日本TAKARA公司),BCA试剂盒、EdU增殖检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),BMI1、GAPDH抗体(英国Abcam公司),AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(杭州昊鑫生物科技股份有限公司)。

1.2.2 细胞miR-135a-5p和BMI1

mRNA相对表达量检测弃去细胞培养基，PBS清洗细胞后，收集细胞，Trizol法裂解并提取细胞总RNA。RNA经反转录后生成cDNA。按SYBRPremixExTaqTMⅡ试剂盒说明书进行操作，采用实时荧光定量PCR法检测细胞miR-135a-5p和BMI1mRNA相对表达量，引物序列见表1。反应体系：2×SYBRgreenmastermix10μL,上、下游引物各1μL,模板cDNA2μL,DEPC-H2O6μL。反应条件：95℃30s;95℃5s,60℃40s,40个循环；95℃15s,60℃30s,95℃15s。miR-135a-5p表达以U6为内参基因，BMI1表达以GAPDH为内参基因，采用2—△△Ct法计算miR-135a-5p和BMI1mRNA相对表达量，实验重复3次，取平均值。选择与HOK细胞比较，miR-135a-5p和BMI1mRNA表达变化最明显的SCC25细胞进行后续实验。

1.2.3 细胞BMI1蛋白相对表达量检测

采用Westernblot法。弃去SCC25细胞培养基，PBS清洗细胞后，收集细胞。RIPA裂解液充分裂解细胞，收集细胞上清液。按BCA试剂盒说明书测定上清液蛋白浓度。取30μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，进行转膜操作。将凝胶中的蛋白转印至PVDF膜上。质量分数5%脱脂奶粉室温条件下封闭2h,添加兔抗人BMI1(1■2000)和GAPDH(1■2000)抗体稀释液，4℃孵育过夜。随后加入HRP标记的山羊抗兔IgG(1■5000),室温条件下孵育1h。滴加ECL发光液，凝胶成像系统检测蛋白条带，ImageJ软件分析各蛋白条带的灰度值。选择与HOK细胞比较，BMI1蛋白表达变化最明显的SCC25细胞进行后续实验。

1.2.4 细胞培养与分组

对数生长期SCC25细胞经胰酶液消化，添加含体积分数10%FBS的RPMI-1640培养基终止消化并重悬细胞。将SCC25细胞接种至6孔板内，每孔数量为2×105个。细胞继续培养24h后，将细胞培养基更换为新鲜培养基。依据LipofectamineTM2000说明书进行转染操作。对数生长期SCC25细胞分为miR-NC组(转染miR-NC)、miR-135a-5p模拟物组(转染miR-135a-5p模拟物)、空白对照组(不进行转染操作)。转染结束后，将细胞放回培养箱内，继续培养48h后，采用实时荧光定量PCR法检测3组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA相对表达量，采用Westernblot法检测3组细胞BMI1蛋白相对表达量，方法同上。

1.2.5 荧光素酶报告实验检测miR-135a-5p和BMI1的靶向关系

应用StarBasev2.0软件预测miR-135a-5p和BMI1的潜在结合位点，根据预测的结合位点，构建BMI1野生型(BMI1-WT)和BMI1突变型(BMI1-MUT)报告基因质粒。将对数生长期SCC25细胞接种至6孔板内，每孔数量为2×105个。细胞继续培养24h后，将细胞培养基更换为新鲜培养基。将对数生长期SCC25细胞分为miR-NC+BMI1-WT组、miR-NC+BMI1-MUT组、miR-135a-5p模拟物+BMI1-WT组、miR-135a-5p模拟物+BMI1-MUT组，依照LipofectamineTM2000说明书分别转染miR-NC+BMI1-WT、miR-NC+BMI1-MUT、miR-135a-5p模拟物+BMI1-WT、miR-135a-5p模拟物+BMI1-MUT,转染后细胞继续培养48h,按照荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明书检测4组细胞荧光素酶活性。

1.2.6 miR-135a-5p对BMI1表达的影响

对数生长期SCC25细胞再分为miR-NC+pcDNA-NC组(转染miR-NC和pcDNA-NC)、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组(转染miR-135a-5p模拟物和pcDNA-NC)、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组(转染miR-135a-5p模拟物和pcDNA-BMI1)和对照组(不进行转染操作);转染结束后继续培养48h,然后向各组细胞内添加50μmol/LL-OHP(该浓度由CCK-8实验结果决定),细胞继续培养24h后，进行后续实验操作。采用实时荧光定量PCR法检测4组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA相对表达量，采用Westernblot法检测4组细胞BMI1蛋白相对表达量，方法同上。

1.2.7 细胞活力检测及L-OHP对SCC25细胞的半数抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration,IC50)

采用CCK-8法。将转染后的SCC25细胞接种于96孔板内，每孔细胞数量为5×103个。细胞置于培养箱内继续培养24h后，将细胞培养基更换为新鲜培养基，并向细胞内分别添加0、5、10、20、40、80、160μmol/LL-OHP。细胞置于培养箱内继续培养24h后，向细胞中添加CCK-8溶液(10μL/孔),细胞于37℃、体积分数5%CO2培养箱中静置孵育4h后，应用酶标仪测定每孔在450nm处吸光度(opticaldensity,OD)值。细胞活力=(实验组OD值/0μmol/L空白对照组OD值)×100%。采用GraphPadPrism5.0软件分析L-OHP对各组细胞的IC50,并确定在后续实验中L-OHP的浓度。

1.2.8 细胞增殖能力检测

采用EdU增殖实验检测细胞增殖能力。将转染后的SCC25细胞接种于96孔板内，每孔细胞数量为5×103个。24h后，向各组细胞内添加50μmol/LL-OHP,继续培养24h后，弃去细胞培养基，添加含50μmol/L的EdU培养基，细胞于37℃培养箱内孵育2h。弃去培养基，PBS清洗细胞，添加体积分数4%多聚甲醛固定30min。PBS清洗细胞，添加体积分数0.5%TritonX-100孵育15min。PBS清洗细胞，添加1×Apollo染色反应液，室温避光孵育30min。PBS清洗细胞，加入DAPI进行核染色。PBS清洗细胞后，荧光显微镜观察细胞染色情况。以EdU阳性细胞数表示细胞增殖能力。

1.2.9 细胞迁移和侵袭能力检测

采用Transwell实验检测迁移细胞数和侵袭细胞数。无血清培养基重悬SCC25细胞，并将其接种于Transwell上室(Transwell上室置于24孔板内),细胞数量为5×104个/孔。下室中添加600μL含体积分数10%FBS的RPMI1640培养基，继续培养24h。24h后，取出小室，体积分数4%多聚甲醛固定15min,加入结晶紫染色液染色15min。显微镜观察细胞迁移情况。侵袭实验中应用的Transwell小室由质量分数20%Matrigel包被，迁移实验中Transwell小室未用Matrigel包被。侵袭实验其余步骤与迁移实验相同。

1.2.10 细胞凋亡率检测

收集SCC25细胞，预冷PBS清洗细胞2次。重新收集细胞，加入1×结合缓冲液重悬细胞沉淀，将细胞密度调整为1×106个/mL。取上述细胞悬液100μL,向细胞中添加5μLFITC-AnnexinV和5μLPI工作液，充分混匀后，室温下避光孵育15min。加入400μL1×结合缓冲液，充分混匀后，应用流式细胞仪，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。

1.3 统计学处理

应用SPSS21.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验；检验水准α=0.05。

2、结果

2.1 HOK、CAL-27、SCC9和SCC25细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量比较

CAL-27、SCC9和SCC25细胞miR-135a-5p相对表达量均低于HOK细胞(P<0.05),BMI1mRNA和蛋白相对表达量均高于HOK细胞(P<0.05)。与HOK细胞比较，SCC25细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量差异最大，选用SCC25细胞进行后续实验。见图1,表2。

2.2 miR-NC组、miR-135a-5p模拟物组、空白对照组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量比较

miR-135a-5p模拟物组细胞miR-135a-5p相对表达量高于miR-NC组、空白对照组(P<0.05),BMI1mRNA和蛋白相对表达量均低于miR-NC组、空白对照组(P<0.05);miR-NC组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量与空白对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3,图2。

2.3 荧光素酶报告实验结果

StarBasev2.0软件预测miR-135a-5p和BMI1的潜在结合位点见图3。miR-135a-5p模拟物+BMI1-WT组细胞荧光素酶活性(1.00±0.43)低于miR-NC+BMI1-WT组(0.42±0.21)(t=18.320,P<0.001),miR-135a-5p模拟物+BMI1-MUT组(1.00±0.73)与miR-NC+BMI1-MUT组(1.08±0.56)比较差异无统计学意义(t=1.230,P=0.760)。miR-135a-5p靶向BMI1。

2.4 对照组、miR-NC+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量比较

4组细胞miR-135a-5p、BMI1mRNA和蛋白相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05)。miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组细胞miR-135a-5p相对表达量均高于对照组、miR-NC+pcDNA-NC组(P<0.05),对照组与miR-NC+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组与miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组细胞BMI1mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组、miR-NC+pcDNA-NC组(P<0.05),miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组均高于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组(P<0.05),对照组与miR-NC+pcDNA-NC组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4,图4。

2.5 对照组、miR-NC+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组L-OHP对细胞的IC50及EdU阳性细胞数比较

对照组L-OHP对细胞的IC50接近50μmol/L,后续实验选择L-OHP50μmol/L处理各组细胞。miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组L-OHP对细胞的IC50、EdU阳性细胞数均低于miR-NC+pcDNA-NC组、对照组(P<0.05),miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组均高于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组(P<0.05),miR-NC+pcDNA-NC组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

2.6 对照组、miR-NC+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组迁移细胞数、侵袭细胞数、细胞凋亡率比较

miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组迁移细胞数、侵袭细胞数少于miR-NC+pcDNA-NC组、对照组(P<0.05),细胞凋亡率高于miR-NC+pcDNA-NC组、对照组(P<0.05);miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组迁移细胞数、侵袭细胞数多于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组(P<0.05),细胞凋亡率低于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组(P<0.05);miR-NC+pcDNA-NC组迁移细胞数、侵袭细胞数、细胞凋亡率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表6。

3、讨论

TSCC是人类常见口腔癌，可导致言语障碍、咀嚼和吞咽困难。手术切除辅助放、化疗和靶向治疗是TSCC的主要治疗方法，但患者5年生存率低，目前TSCC发病率呈增加趋势[7]。因此，阐明TSCC复杂的发病机制，探讨改善TSCC化疗敏感性的可能方案具有重要意义。

miRNAs在细胞中既是肿瘤抑制因子又是癌基因。miRNAs失调与人类肿瘤发生、转移和耐药密切相关[8]。研究miRNAs参与癌症发生和发展的机制有助于寻找有效的治疗靶点，改善肿瘤化疗敏感性[9]。miR-135a-5p在不同肿瘤中发挥不同作用。研究[10]发现，卵巢癌组织miR-135a-5p表达下调，过表达miR-135a-5p可通过靶向C-C趋化因子受体2型抑制卵巢癌细胞的体外增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化，发挥抑制肿瘤转移的作用。研究[11]发现，在TSCC肿瘤组织和正常组织中共鉴定出191个miRNAs差异性表达(98个上调，93个下调),其中miR-135a-5p在癌组织中表达下调。Zheng等[12]研究证明，miR-135a-5p在TSCC中发挥抑癌作用。miR-135a-5p通过靶向lncRNADANCR和Krüppel样转录因子8,可降低TSCC细胞存活率，抑制细胞迁移和侵袭。本研究结果显示，CAL-27、SCC9和SCC25细胞miR-135a-5p相对表达量低于HOK细胞，与HOK细胞比较，SCC25细胞miR-135a-5p相对表达量差异最大，选择SCC25细胞进行后续实验；miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组细胞BMI1mRNA和蛋白相对表达量、L-OHP对细胞的IC50、EdU阳性细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数均低于miR-NC+pcDNA-NC组，细胞凋亡率高于miR-NC+pcDNA-NC组，说明SCC25细胞miR-135a-5p过表达可明显降低L-OHP对SCC25细胞的IC50,抑制L-OHP处理的SCC25细胞的增殖、迁移、侵袭，促进细胞凋亡；提示miR-135a-5p可促进SCC25细胞对L-OHP的敏感性。

BMI1通过组蛋白2A在酪氨酸119(H2AK119ub)的单一泛素化而抑制基因转录。BMI1mRNA或蛋白异常表达在人类恶性肿瘤中广泛存在，与晚期疾病分期、侵袭性临床病理行为、不良预后及对放化疗的抵抗有关[13]。BMI1参与卵巢癌顺铂耐药的形成。miR-132通过靶向调控BMI1,可提高卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性，抑制细胞迁移和侵袭，促进细胞凋亡[14]。BMI1高表达与口腔鳞状细胞癌临床病理行为及患者生存率相关，是口腔鳞状细胞癌患者预后的潜在标志物[15]。应用BMI1选择性抑制剂PTC-209可导致头颈部鳞状细胞癌细胞增殖受损，G1期细胞周期阻滞，迁移和侵袭能力受损，细胞凋亡增加，癌细胞对氟尿嘧啶和顺铂的敏感性增高[16]。此外，miR-135a-5p通过靶向BMI1可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭，阻碍胶质瘤进展[17]。

本研究结果显示，miR-135a-5p和BMI1存在潜在结合位点；miR-135a-5p模拟物+BMI1-WT组细胞荧光素酶活性低于miR-NC+BMI1-WT组，miR-135a-5p模拟物+BMI1-MUT组与miR-NC+BMI1-MUT组比较差异无统计学意义，说明miR-135a-5p靶向调控BMI1表达。本研究结果显示，miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组BMI1mRNA和蛋白相对表达量、L-OHP对细胞的IC50、EdU阳性细胞数、迁移细胞数、侵袭细胞数均高于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组，细胞凋亡率低于miR-135a-5p模拟物+pcDNA-NC组，说明过表达BMI1可减弱miR-135a-5p模拟物对L-OHP处理的SCC25细胞的作用，促进SCC25细胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡。提示miR-135a-5p通过靶向调控BMI1促进SCC25细胞对L-OHP的敏感性。但本研究未设立miR-NC+pcDNA-BMI1组(转染miR-NC和pcDNA-BMI1),未与miR-NC+pcDNA-NC组、miR-135a-5p模拟物+pcDNA-BMI1组进一步比较以证明miR-135a-5p靶向BMI1对TSCC细胞L-OHP敏感性的影响；miR-135a-5p靶向BMI1增加TSCC细胞L-OHP敏感性的具体机制也有待进一步探讨，以进一步明确TSCC发病机制并改善其对L-OHP敏感性。

本研究结果提示，miR-135a-5p在TSCC细胞系呈低表达，BMI1在TSCC细胞系呈高表达；过表达miR-135a-5p通过靶向抑制BMI1的表达，促进SCC25细胞对L-OHP的敏感性，为明确TSCC发病机制及改善对L-OHP的敏感性提供了新依据。

参考文献:

[7]刘继华,张学武,鲍慧.人口腔鳞状细胞癌SCC9细胞miR-146a-5p表达及对细胞增殖和凋亡的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(9):884-887.

[8]周瓯杰,金焰,于最翠外泌体micORNA在肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞间交互影响中作用研究进展[J].中华实用诊断与治疗杂志,2020,34(12):1282-1286.

[9]李刚强,才志刚,胡建,等.肺腺癌患者痰液中相关微小RNA表达及临床意义[J].中华实用诊断与治疗杂志,2017,31(1):45-47.

文章来源：卢娜,张强,袁荃,王晓波.miR-135a-5p增强舌鳞状细胞癌细胞对奥沙利铂敏感性研究[J].中华实用诊断与治疗杂志,2021,35(12):1191-1197.