首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 肿瘤科论文 > 肿瘤治疗论文 > 循环肿瘤DNA与转移性结直肠癌靶向治疗及耐药机制的相关研究

循环肿瘤DNA与转移性结直肠癌靶向治疗及耐药机制的相关研究

2021-11-24 47 上传者：管理员

摘要：目的探讨转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer, mCRC）耐药相关的点突变,明确循环肿瘤DNA（circulating tumour DNA,ctDNA）能否作为mCRC检测和耐药相关的突变分子标志物以及mCRC可能的耐药机制。方法通过对连续抗表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）单抗药物治疗的mCRC患者多阶段ctDNA进行KRAS、BRAF和PIK3CA基因点突变动态监测,构建药物作用下的肿瘤基因突变谱变化,筛选耐药相关点突变;培养相应点突变细胞系后,通过体外细胞增殖试验（MTS法）分析细胞系的耐药程度,实时荧光定量PCR（real-time quantitativePCR,RT-qPCR）检测药物作用对突变丰度的影响。结果通过临床数据分析,筛选出可能与mCRC耐药相关的点突变KRAS（G12D）、PIK3CA（H1047R）和BRAF（V600E）,并纳入后续研究。选择NCI-H747、SW948和SW1417细胞系分别作为KRAS（G12D）、PIK3CA（H1047R）和BRAF（V600E）点突变的细胞系,并选用C2BBe1野生型细胞系作为本底细胞。MTS半数抑制浓度即IC50测定发现,野生型细胞系对西妥昔单抗和帕尼单抗敏感性均较突变细胞高;经与本底细胞稀释后,西妥昔单抗组和帕尼单抗组在培养3 d后突变基因相对水平均比不加药组高,不加药组均比基线组高。结论 ctDNA检测能够发现与耐药相关的点突变;KRAS（G12D）、PIK3CA（H1047R）和BRAF（V600E）点突变可提高转移性结直肠癌细胞生长速度,并与西妥昔单抗和帕尼单抗耐药相关。

关键词：
循环肿瘤DNA
耐药机制
诊疗方式
转移性结直肠癌
靶向治疗
加入收藏

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是人类最常见的恶性肿瘤之一，尽管诊疗方式不断更新，但预后情况仍不乐观，尤其是转移性结直肠癌(metastatic colorectal cancer, mCRC)其5年生存率仅为13%[1]。近年来抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)单克隆抗体分子靶向治疗mCRC取得了较好疗效。然而，研究发现KRAS、BRAF和PIK3CA等基因突变的mCRC患者对靶向治疗有效率仅约10%[2,3]。因此，早期靶向突变基因检测是判断mCRC疗效的关键。研究显示，循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA,ctDNA)是肿瘤细胞主动释放或被动脱落进入血液循环的DNA片段，携带有完整的肿瘤特异性遗传学改变基因组信息，通过检测ctDNA可以明确相关肿瘤的遗传学改变[4]。为寻求mCRC有效的靶向治疗分子标记物，本研究通过对mCRC患者多阶段ctDNA进行KRAS、BRAF和PIK3CA基因点突变检测和生物信息学分析，构建药物压力下的肿瘤基因突变谱变化，筛选耐药相关点突变，并在体外验证这些突变是否与耐药相关，从而明确ctDNA能否作为mCRC耐药相关的突变分子标志物，探讨mCRC患者可能存在的耐药机制。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

人类KRAS、BRAF和PIK3CA基因突变检测试剂盒：购自厦门艾德有限公司；MTS试剂：购自美国Promega公司；基因提取试剂盒：购自天根生化科技有限公司。

1.1.2细胞株

NCI-H747:结直肠癌细胞株，RPMI-1640培养基；SW948:结直肠癌细胞株，Leibovitz's L-15培养基；SW1417:结直肠癌细胞株，Leibovitz's L-15培养基；C2BBe1:结直肠癌细胞株，DMEM高糖培养基；培养液：10%胎牛血清，加入青霉素和链霉素各100 U/ml;培养条件：置37℃、5% CO2细胞培养箱培养。

1.1.3药品

西妥昔单抗：购自selleckchem公司；帕尼单抗：购自selleckchem公司。

1.2试验方法

1.2.1临床样本ctDNA数据收集

选取经抗EGFR单抗连续治疗的mCRC患者30例，在连续给药期间的第0 d、第(56±2)d、第(112±2)d、第(168±2)d……(以28 d为1周期，每2个周期采血一次)抽取静脉血5 ml, 4 000 r/min离心10 min,收集上清，冷冻保存。提取患者多个阶段的外周血ctDNA,RT-qPCR检测ctDNA中KRAS、PIK3CA和BRAF基因突变，明确药物压力下肿瘤基因突变谱变化，筛选耐药相关点突变。

1.2.2选定相关细胞系

在CCLE数据库选取对应点突变的肿瘤细胞系。

1.2.3药物IC50浓度的测定

将选取的细胞系在96孔板内培养24 h,帕尼单抗和西妥昔单抗分别等比稀释成8个不同浓度，每孔加入已配制好含有不同浓度药物的培养基，培养72 h弃去含药物培养基后加入含有MTS溶液的培养基，进行吸光度值的检测，计算药物IC50的浓度。

1.2.4药物处理选定的细胞系

分别将点突变细胞与本底细胞混合成一定浓度后分为4份，1份在未加药物时提取DNA,其余3份分别加帕尼单抗、西妥昔单抗以及不加药培养基，培养72 h后提取DNA,其中加入药物的浓度为IC50值的浓度。

1.2.5细胞经药物处理前后突变基因相对变化

RT-qPCR检测4份DNA中KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)基因突变丰度，验证该突变基因与肿瘤细胞对帕尼单抗和西妥昔单抗耐药的相关性。

1.3统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，首先进行数据的正态性检验，若为正态分布，数据统计量用均数±标准差(x¯±s)表示，并采用t检验分析组间差异；若为非正态分布，数据统计量用中位数和范围来表示，并用Mann-Whitney检验分析组间差异，检验水准α=0.05。

2、结果

2.1可能与耐药相关的点突变

30例连续抗EGFR药物治疗的mCRC患者不同阶段外周血ctDNA突变频率变化如图1所示。其中有10例出现了KRAS基因12密码子突变，共检出3种突变类型：6例突变类型为G12D( Gly12Asp) ,碱基变化为GGT>GAT;2例突变类型为G12V( Gly12Val),碱基变化为GGT>GTT;1例G12D合并G12A ( Gly12Ala )突变，1例G12D合并G12V( Gly12Val)突变。其中5例出现了PIK3CA基因9号和20号外显子突变，共检出3种突变类型：3例突变类型为H1047R(3140A>G),1例E542K(1624G>A),1例H1047R合并E545D (1633G>T);其中3例出现了BRAF突变，突变类型均为V600E;3例出现KRAS合并PIK3CA基因突变。检测的三种基因点突变频率最高的是KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)类型，故将该点纳入下一步研究。

图1患者ctDNA中点突变频率变化趋势图

2.2细胞系的选定及基本信息采集

根据筛选出的结直肠癌耐药频率最高的点突变类型及细胞系的状态采集，KRAS(G12D)突变类型选用NCI-H747细胞系，PIK3CA(H1047R)选用SW948细胞系，BRAF(V600E)选用SW1417细胞系。同时选用C2BBe1野生型细胞系作为本底细胞和对照。突变细胞和野生型细胞均为结直肠癌细胞，并经测序验证突变类型的正确性。

表1不同细胞系对不同药物的IC50值(umol/L)

2.3野生型和点突变型细胞系对药物的IC50值测定

表1显示，4种细胞系对西妥昔单抗和帕尼单抗的IC50值。如图2所示，3种点突变的细胞对两种药物的IC50值均比野生型细胞高(P<0.05),表明经点突变后的细胞对两种抗EGFR单抗药物的敏感性降低。

图2不同细胞系对不同药物的IC50值(umol/L)

图2不同细胞系对不同药物的IC50值(umol/L) 2.4各细胞系经药物处理前后突变基因水平相对变化

采用RT-qPCR分析了各点突变细胞系经药物处理前后KRAS(G12D)、PIK3CA (H1047R)和BRAF(V600E)变化情况。从表2可知，不管加或不加药，3 d之后基因突变相对水平均高于基线水平，而加药后三种基因突变相对水平均高于不加药组，见图3。

表2突变基因的相对表达量

图3突变基因相对表达量

3、讨论

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是HER/ErbB家族的一员，可于结直肠癌在内的多种恶性肿瘤中过度表达[5]。西妥昔单抗和帕尼单抗是两种常见的抗EGFR单克隆抗体(MoAbs),两者联合化疗药物作用于mCRC患者，可使其中位总生存期从6个月提高至近30个月，显著改善mCRC患者的生存质量及预后[6,7]。

然而大型临床研究证实48%的mCRC癌患者至少携带一种耐药基因突变，对此类药物治疗无效。同时，临床研究表明大多数癌症患者并非死于原发性癌症而是癌症的转移，导致癌症转移的信号众多，其关键作用靶点及具体作用机制尚不完全清楚，因此癌症转移是癌症治疗中的难题[8,9]。抗EGFR治疗的原发、继发性耐药机制极大地限制了抗EGFR单抗药物的应用，耐药肿瘤细胞的早发现是克服EGFR耐药的关键之一。已有研究发现KRAS、BRAF和PIK3CA等基因突变可导致肿瘤对抗EGFR单抗耐药[10,11]。因此，抗EGFR治疗耐药后，可通过耐药基因突变检测，对突变激活通路行靶向干预，为制定个体化的逆转耐药方案争取时间[12]。随着人们对肿瘤发展机制及其分子特征的不断探索，“液态活检”ctDNA已成为有效检测抗EGFR治疗继发性耐药突变的重要检测手段[13,14]。ctDNA是由机体细胞释放入外周血循环后发生部分降解的内源性DNA,与肿瘤细胞基因组信息相一致，并能克服组织活检有创性、组织异质性等特点。

另外，有文献报道与耐药相关的肿瘤突变细胞会随着药物压力作用逐渐富集[15]。因此，本文通过对患者ctDNA的动态监测，可以观察到耐药细胞亚群会占据优势，并且可从中筛选与耐药相关的点突变，进行耐药机制的探索。本试验研究得到mCRC患者中突变频率最高的基因是KRAS(10/30,33.3%),突变频率最高的点突变是G12D。这与我国学者潘洋滔等[16]研究114例mCRC患者KRAS和BRAF基因突变，其中以G12D突变最多，占49.06%,结果较一致。KRAS是RAS基因家族的一员，当KRAS基因突变后，表达的RAS蛋白为GAP敏感型即抑制RAS与GAP反应，引起RAS的持续活化不断地与GTP结合，使下游的RAF-MEK-ERK通路持续激活，引发肿瘤[17]。此外本研究对PIK3CA和BRAF突变基因也进行了检测，突变频率分别为16.7%和10.0%。其中PIK3CA突变主要是H1047R突变，表明PIK3CA(H1047R)在转移性结直肠癌细胞耐药中可能起着重要的作用；而BRAF基因突变类型仅为V600E,与文献[16]报道的BRAF基因突变类型相符。提示在临床实践中BRAF突变型mCRC患者在治疗前也需谨慎。

筛选出KRAS、PIK3CA和BRAF基因最高突变类型后，本试验培养出相应点突变细胞系和野生型细胞系，并行测序验证。同时，利用CRC治疗疗效较好的西妥昔单抗和帕尼单抗两种药物处理野生型细胞系和各点突变细胞系，并进行药物IC50测定，考察各细胞对药物敏感性的变化。研究发现，野生型细胞的西妥昔单抗和帕尼单抗IC50值均比各点突变细胞要低，也就是说，细胞经KRAS、PIK3CA和BRAF点突变后，对两种抗EGFR单抗药物的敏感性都显著降低。

虽然上述药物IC50值结果显示各点突变细胞系对药物的敏感性降低，但是也无法说明这是由该试验研究的三个目标点突变造成的影响。因此，为进一步探索目标点突变是否与耐药相关，本试验将野生型细胞和各目标点突变细胞混合，其中均使野生型细胞占主体。同时将每份混合细胞群体分为4份，第1份作为基线组，在第0 d提取DNA,其余3份分别为西妥昔单抗组、帕尼单抗组和不加药组，即用西妥昔单抗、帕尼单抗和不加药培养基培养3 d后提取DNA,观察各点突变基因相对水平的变化。本试验得出，即使不加药，3 d后突变KRAS、PIK3CA和BRAF的水平也是升高的，考虑是KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)引起细胞生长速度加快所导致，其中以KRAS突变引起细胞生长加速最为显著。既往文献[18,19,20]报道，携带有KRAS(G12D)和PIK3CA(H1047R)点突变细胞的生长速度、迁移能力、转移能力均升高，和本文得出到的结果一致。研究还发现，加用西妥昔单抗、帕尼单抗之后，三种点突变细胞水平比不加药明显升高，也就是说，加用这两种抗EGFR单抗药物后，携带有KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)点突变的细胞比例变得更高，说明这三个点突变与西妥昔单抗和帕尼单抗耐药相关。

本试验通过对临床ctDNA数据动态研究，发现可能与抗EGFR药物耐药相关的点突变，经选定相应点突变细胞系、野生型细胞稀释、药物处理，最后通过RT-qPCR检测，发现用药前后突变基因相对水平的变化，明确了ctDNA检测能够发现与耐药相关的点突变，验证了KRAS(G12D)、PIK3CA(H1047R)和BRAF(V600E)点突变确实与结直肠癌细胞对西妥昔单抗和帕尼单抗的耐药相关。这些发现使得在含有此突变患者身上使用靶向治疗成为可能，为受益患者的精准诊疗提供依据。

参考文献：

[1]王锡山从中美结直肠瘤流行病学特征着结直肠癌早诊早治的重要性[J.中华结直肠疾病电子杂志, 201.01)26-33.

[9]蔡讯,李琦结直肠癌少见和罕见靶点治疗药物进展[J]医药专论,2020,41(11):839-843.

[16]潘洋滔,黄学锋转移性结直肠癌中发生KRAS.与BRAF基因同时突变的病例探究[J].全科医学临床与教育,2020,18(8):678-681.

[20]陈馨宁,黄斐,沈敏娜,等转移性结直肠癌患者ctDNA基因突变检测方法的比较及影响因素分析[J]中国癌症杂志,2021,31(3):192-197.

文章来源：李建英,毛玉环,张晓,周琼,谭黎明.循环肿瘤DNA与转移性结直肠癌靶向治疗及耐药机制的相关研究[J].实用预防医学,2021,28(12):1450-1454.