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马源芽孢杆菌的分离与初步鉴定

2021-09-26 47 上传者：管理员

摘要：为了从健康成年马肠道分离芽孢杆菌,为兽用益生菌制剂的研究提供丰富的菌株来源。试验采用从健康成年马粪便,使用营养肉汤培养基增菌培养后,入90℃水浴锅中恒温水浴20min,将高温处理后的肉汤培养物在营养琼脂培养基上进行划线分离,挑起单个菌落经3～5次多次划线分离后,获得纯菌株5株。对分离菌株的培养特性、形态特征、生化特性及运动性进行观察,结果表明分离菌均符合芽孢杆菌的特征,说明分离菌均为芽孢杆菌。

关键词：
分离
成年马
粪便
芽孢杆菌
鉴定
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动物肠道中益生菌的种类繁多，芽孢杆菌是其中的一大类，能产生蛋白酶、纤维素酶等多种消化酶及产生维生素、氨基酸多种营养物质，促进动物的生长发育及免疫力的形成。益生芽孢杆菌能够产生芽孢，因芽孢对外界不良环境具有强大的抵抗力，能抵抗胃酸进入肠道定植，故益生芽孢杆菌在养殖业中应用广泛[1,2,3,4]。马的肠道十分发达，盲肠是马属动物的主要发酵室，含有大量的微生物，在消化中占有重要地位[5]。国内文献对猪源[6,7,8,9]、禽源[10]、山羊源[11]、牛源[12,13]肠道芽孢杆菌均有大量研究报道，但对马源肠道芽孢杆菌的研究鲜见报道[5]。本研究旨在从健康马粪便中分离益生芽孢杆菌，为动物微生态制剂的开发提供菌株来源。

1、材料与方法

1.1材料

1.1.1试验用粪便

试验用粪便来自北京农业职业学院畜牧场的5匹健康成年马。5匹健康成年马依次为汗血宝马（学名阿哈尔捷金马），毛色为棕黑色，原产于土库曼斯坦，其粪样命名为F1（赛马）。安达卢西亚马，毛色为白色，原产地西班牙，其粪样命名为F2（白马）；德保矮马1、德保矮马2、德保矮马3，原产地中国广西德保县，其粪样分别命名为F3（矮马1）、F4（矮马2）、F5（矮马3）。

1.1.2对照用菌种

马大肠杆菌来自微生物实验室。

1.1.3主要试剂

从青岛高科园海博生物技术有限公司购买营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、半固体培养基、生化鉴定所用全部试剂等。

1.2方法

1.2.1细菌分离

(1）样品采集与处理：清晨自牧场采集F1（赛马）、F2（白马）、F3（矮马1）、F4（矮马2）、F5（矮马3）的新鲜粪便，4℃保存备用。（2）增菌培养：无菌操作从上述5匹马新鲜粪便的中心取粪样适量，放入营养肉汤培养基中，用接种环打散混匀，做好标记，置37℃恒温培养4～5d。（3）分离芽孢菌：将营养肉汤培养物放入90℃水浴锅中恒温水浴20min，将水浴后的培养物分别接种于营养肉汤培养基、营养琼脂平板培养基、麦康凯琼脂平板培养基37℃恒温培养24h后，在营养琼脂平板培养基反复划线分离至获得纯菌株。

1.2.2细菌鉴定

(1）菌落及菌体形态学观察：从健康成年马粪便，使用营养肉汤培养基增菌培养后，入90℃水浴锅中恒温水浴20min，将高温处理后的肉汤培养物在营养琼脂培养基上进行划线分离，挑起单个菌落经3～5次多次划线分离后，获得纯菌株5株。仔细观察并记录5株菌的菌落形态。将5株纯菌株分别制片革兰氏染色后，用显微镜油镜观察细菌的形态特点。（2）生化试验：将分离的5株纯菌株进行糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验、明胶液化试验、淀粉水解试验，37℃培养1～3d，观察结果。同时用大肠杆菌为对照株进行上述生化试验。（3）麦康凯琼脂平板生长试验：将分离纯化的菌株和对照株大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上进行划线分离，37℃培养1～3d，观察结果。（4）运动性检查：将分离纯化的菌株和对照株大肠杆菌在半固体培养基穿刺接种，37℃培养1～3d，观察结果。

2、结果与分析

2.1细菌分离结果

分离菌株在营养肉汤培养基中生长表现为肉汤均匀混浊，管底有黏性沉淀，振摇后能均匀分散。分离菌株在营养琼脂培养基形成扁平、粗糙、干燥的灰白色菌落。分离菌在麦康凯琼脂平板培养基上均不生长。

2.2细菌鉴定结果

2.2.1菌落形态

分离菌株在营养肉汤培养基中生长表现为肉汤均匀混浊。管底有黏性沉淀，振摇后测能均匀分散。F1（赛马）、F2（白马）、F3（矮马1）、F4（矮马2）、F5（矮马3）液面形成菌膜。F1（赛马）、F2（白马）、F3（矮马1）、F4（矮马2）菌株在营养琼脂平板培养基形成菌落特征相似，为圆形、扁平、较粗糙、干燥、表面无皱缩的灰白色菌落。F5（矮马3）菌株在营养琼脂平板培养基形成扁平、粗糙、干燥、表面明显皱缩的灰白色菌落。分离菌株在营养琼脂平板培养基上生长的菌落特点（图1），符合芽孢杆菌的特征。

2.2.2革兰氏染色镜检

菌体形态可见：从F1（赛马）、F2（白马）、F3（矮马1）、F4（矮马2）、F5（矮马3）分离到的细菌均为G+杆菌，为长杆状，菌体粗，菌体间形成短链状，产生芽孢，芽孢为椭圆形，位于菌体的中央，不大于菌体。符合芽孢杆菌的特征。

2.2.3细菌生化试验

5株分离菌的生化试验结果见表1。

由表1可见，分离菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖（F1不分解）、麦芽糖（F4不分解）、甘露醇和果糖，不产酸，不产生吲哚，淀粉水解试验阳性，明胶液化试验均为阴性。对照菌大肠杆菌能分解葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇和果糖，并产酸产气，产生吲哚，甲基红试验阳性，淀粉水解试验和明胶液化试验均为阴性。分离菌的生化试验基本符合芽孢杆菌的特征。

2.2.4麦康凯琼脂平板生长试验结果

将分离纯化的菌株在麦康凯琼脂平板进行划线分离，37℃培养1～3d，均无细菌生长。而对照的大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上生长良好，菌落呈粉红色。

2.2.5运动性检查结果

在半固体培养基穿刺培养过程中，分离菌株（见图2中左边试管）穿刺线清晰，四周未见云雾状扩散生长，说明均不产生鞭毛，无运动性，符合芽孢菌的特点。而对照的大肠杆菌（见图2中右边试管）有鞭毛能运动，在培养基中沿四周呈云雾状扩散生长。

3、讨论与结论

根据细菌分离、革兰氏染色镜检、培养特性、生化试验、运动性检查结果可知，分离得到的5株肠道菌均符合芽孢杆菌的特征，故F1（赛马）、F2（白马）、F3（矮马1）、F4（矮马2）、F5（矮马3）初步鉴定为芽孢杆菌。在后续的工作中将用16SrDNA序列分析法对所分离的细菌进行鉴定，以确定其分类学地位。

试验过程中，分离的芽孢杆菌在营养琼脂斜面上保存3个月后仍然存活，但大肠杆菌已经失去活性。说明分离的芽孢杆菌生命力强，易于在营养琼脂斜面上长期保存。为了获得纯菌株或有杂菌污染时，可用芽孢杆菌的营养肉汤培养物放入90℃水浴锅中恒温水浴20min杀灭杂菌后再进行培养即可。

在细菌分离过程中，分离的芽孢杆菌在营养肉汤培养基、营养琼脂平板培养基等基础培养基上生长良好，说明芽孢杆菌对营养要求不高，易于培养。分离芽孢杆菌在麦康凯琼脂平板上不生长、半固体培养基上没有运动性，可以和有鞭毛的大肠杆菌相区别。

在生化试验过程中，大肠杆菌的糖发酵试验、吲哚试验、甲基红试验均呈阳性，淀粉水解试验和明胶液化试验均呈阴性，芽孢杆菌在糖发酵试验中只产酸不产气，在吲哚试验、甲基红试验淀粉水解试验中均呈阴性，故以大肠杆菌作为对照菌进行，有利于试验的观察。

参考文献：

[1]邱雪兴,骆宏机,刘文聪.芽孢杆菌在动物营养与饲料中的应用[J].中国畜牧兽医文摘,2014,30(5):194-195.

[2]谷笑笑,王振华,潘康成.益生芽孢杆菌对动物免疫功能影响研究进展[J].微生物学通报,2016,43(9):2079-2085.