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银杏内酯B对癫痫模型大鼠脑保护作用及其机制研究

2021-11-08 101 上传者：管理员

摘要：目的:探讨银杏内酯B(GB)对癫痫(EP)模型大鼠脑组织的保护作用及其机制。方法:将120只雄性SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、丙戊酸钠(VPA)组与GB低、中、高剂量组,每组20只。除空白对照组外,其余各组大鼠采用氯化锂-匹罗卡品诱导制备EP大鼠模型。注射匹罗卡品前30min,空白对照组和模型组腹腔注射生理盐水,GB低、中、高剂量组分别腹腔注射2.5、5、10mg/kgGB,VPA组腹腔注射300mg/kgVPA。注射匹罗卡品后2h内观察各组大鼠行为学变化,记录EP首次发作潜伏期、发作持续时间,参照Racine分级标准对各组大鼠EP发作程度进行分级。注射匹罗卡品24h后,各组随机取10只大鼠,脑组织固定切片,苏木精-伊红(HE)染色,观察大脑海马组织病理学改变;末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记(TUNEL)法观察各组大鼠海马区神经元凋亡状况。各组剩余的10只大鼠,于注射匹罗卡品24h后,取脑剥离海马,研磨匀浆,离心取上清液,黄嘌呤氧化法和钼酸铵法分别检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力,硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)含量,蛋白质免疫印迹(Westernblot)法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、核因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、激活型Caspase-3(CleavedCaspase-3)蛋白表达。结果:与模型组比较,GB中、高剂量组和VPA组大鼠EP发作潜伏期明显延长、发作持续时间明显缩短(P<0.01),EP发作程度明显降低(P<0.01);海马神经元病变和凋亡状况明显改善,凋亡指数降低(P<0.01);SOD、CAT活力升高且MDA含量降低(P<0.05或P<0.01);Nrf2、HO-1表达上调而NF-κB、CleavedCaspase-3表达下调(P<0.01),CleavedCaspase-3/Caspase-3比值降低(P<0.01)。上述指标除CAT活力外,GB对其他指标的改善作用均表现出剂量依赖性;除CAT活力和Caspase-3表达外,高剂量GB对其他指标的影响均显著优于VPA(P<0.05或P<0.01)。结论:GB对EP模型大鼠具有抗痫和脑组织保护作用,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路进而抑制氧化应激和细胞凋亡有关。

关键词：
SD大鼠
动物行为学
实验研究
海马
癫痫
银杏内酯
雄性
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癫痫(epilepsy，EP)是一种较为常见的慢性神经系统疾病，我国EP患者约900万，每年新发病例约45万，发病率为25～35个/10万，并且具有反复性、自发性的特点，严重危害患者的身心健康[1]。EP发作是神经元过度兴奋和自由基堆积的过程，研究显示EP发作时间超过30min即可造成大脑神经元损伤，海马神经元最为敏感[2]，而氧化应激反应和细胞凋亡在其病变过程中发挥着重要作用[3,4]。核因子E2相关因子2(nuclearfactore2-relatedfactor2，Nrf2)/血红素加氧酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)是细胞调控氧化应激反应和细胞凋亡的关键信号通路[5,6]。银杏内酯B(ginkgolideB，GB)是从银杏叶中提取出的一种倍半萜内酯化合物，具有良好的抗氧化和抗凋亡活性[7]，但GB能否通过抑制氧化应激反应和细胞凋亡减轻EP所致脑组织损伤尚未见文献报道。本实验通过制备EP大鼠模型，研究GB对EP模型大鼠氧化应激、细胞凋亡以及Nrf2/HO-1通路的影响，探讨GB对EP模型大鼠脑保护作用及其机制，现将研究结果报道如下。

1、实验材料

1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠120只，体质量220～250g，由河北省实验动物中心提供[许可证号：SCXK(冀)2018-004]，适应性饲养7d后开展实验。饲养条件：12h光照黑暗交替，温度(25±1)℃，相对湿度(65±5)%。本实验通过邯郸市第二医院伦理委员会审查，伦理批号：HDEYLL〔K〕字2020-024。

1.2 药物与试剂

GB购自美国Sigma公司(批号：BN90418)；注射用丙戊酸钠(valproate，VPA)购自成都诺迪康生物制药有限公司(批号：20190716)；末端脱氧核苷酰基转移酶介导dUTP切口末端标记(TUNEL)染色试剂盒和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购自南京建成生物工程研究所(批号：200413、200326、200113、200308)；兔抗鼠Nrf2、HO-1、核因子-κB(NF-κB)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、激活型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体和羊抗兔IgG二抗购自北京博奥森生物技术有限公司(批号：bs-1074R、bs-23667R、bs-20355R、bs-0081R、bsm-52289R、bs-0061R、bs-0295G)。

1.3 主要仪器

石蜡包埋机(型号：TDK-BMB)，孝感泰康达医疗设备公司；石蜡切片机(型号：RM2125)，德国Leica公司；紫外-可见分光光度计(型号：UV2000)，上海尤尼柯公司；电泳槽(型号：VE180)、转膜仪(型号：VE186VE180)，上海天能科技有限公司；凝胶成像系统(型号：GelDoc2000)，美国Bio-Rad公司；倒置光学显微镜(型号：AI09)，日本奥林巴斯公司。

2、实验方法

2.1 分组、造模与给药

按照随机数字表法将120只SD大鼠随机分为空白对照组、模型组、VPA组和GB低、中、高剂量组，每组20只。除空白对照组外，其余各组大鼠均参照康云霄等[8]报道的氯化锂-匹罗卡品法诱导制备EP大鼠模型：以127mg/kg剂量腹腔注射氯化锂溶液，20h后以15mg/kg剂量背部皮下注射匹罗卡品溶液。空白对照组上述步骤均同步给予生理盐水。各组均在注射匹罗卡品前30min腹腔注射给予相应剂量药物或生理盐水(空白对照组和模型组给予生理盐水，GB低、中、高剂量组给药剂量分别为2.5、5、10mg/kg[9]，VPA组给药剂量为300mg/kg[10])。

2.2 大鼠行为学观察

注射匹罗卡品后2h内观察各组大鼠行为学变化，记录EP首次发作潜伏期、发作持续时间，参照Racine分级标准对各组大鼠EP发作程度进行分级[11]：无发作为0级；须动及口周、面部肌肉抽搐为Ⅰ级；点头或湿狗样频繁抖动为Ⅱ级；前肢局限性阵挛为Ⅲ级；前肢局限性阵挛伴后肢站立的全身强直性发作为Ⅳ级；伴有站立并摔倒、翻滚的全身强直阵挛发作为Ⅴ级。

2.3 大脑海马组织病理学检查和神经元凋亡观察

注射匹罗卡品24h后，各组随机取10只大鼠，麻醉后开胸，暴露心脏，由左心室-右心耳通路依次灌注300mL生理盐水、300mL4%多聚甲醛溶液，断头取脑，置于4%多聚甲醛溶液固定72h后，行石蜡包埋、4μm厚度切片、透明和脱蜡。部分组织切片行常规HE染色，中性树脂封片后通过光学显微镜观察大脑海马组织病理学改变。部分组织切片按照TUNEL试剂盒操作方法进行处理，50%甘油封片后通过光学显微镜观察海马区神经元凋亡状况，细胞核黄褐色为阳性着色。凋亡指数(apoptosisindex，AI)计算：每只大鼠随机取5张切片，计数视野内凋亡细胞数和细胞总数，取比值的百分比，AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。

2.4 大脑海马组织SOD、CAT活力和MDA含量检测

注射匹罗卡品24h后，取各组剩余的10只大鼠，麻醉后脊椎脱臼处死，断头取脑并剥离海马，加入9倍量冷裂解液后研磨匀浆，4℃离心(离心半径10cm，3000r/min，10min)取上清液，然后采用黄嘌呤氧化法和钼酸铵法分别检测SOD、CAT活力，硫代巴比妥酸法检测MDA含量。

2.5 大脑海马组织Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved

Caspase-3蛋白表达检测取“2.4”步骤海马组织匀浆、离心所得的上清液，4℃离心(离心半径10cm，12000r/min，20min)取沉淀，BCA法检测总蛋白浓度，95℃水浴使蛋白变性后，SDS-PAGE胶电泳分离蛋白，湿法转PVDF膜，5%脱脂奶粉37℃封闭1h后，滴加目标蛋白(Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved Caspase-3)和β-actin一抗后4℃孵育过夜，PBS溶液洗膜后滴加IgG二抗37℃孵育1h，洗膜后滴加DAB显色，然后以β-actin为内参半定量目标蛋白表达。

2.6 统计学方法

运用SPSS15.0软件对数据进行统计分析。计量资料以(x−±s)表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3、实验结果

3.1 各组大鼠行为学指标比较

空白对照组大鼠行为正常，未出现EP发作，EP发作级别为0级。模型组大鼠发作程度评级明显高于模型组(P<0.01)。各给药组与模型组组间各项指标比较结果见表1。

3.2 各组大鼠海马组织病理学改变比较

空白对照组大鼠海马神经元呈圆形或椭圆形，排列整齐、层次清晰，核膜、核仁清晰；模型组大鼠海马神经元出现数量减少，形态不规则，排列紊乱、层次不清，核仁固缩、偏移、深染等病理学改变；与模型组比较，GB各剂量组和VPA组大鼠海马神经元上述病理学形态结构改变呈不同程度减轻，其中GB高剂量组海马神经元数量减少不明显，形态较规则，排列较整齐，效果优于其他组。见图1。

3.3 各组大鼠海马神经元凋亡水平比较

空白对照组大鼠海马区仅可见极少量凋亡神经元，AI为(3.48±0.57)%；与空白对照组比较，模型组大鼠海马神经元凋亡数量明显增多，AI为(46.95±8.01)%，明显高于空白对照组(P<0.01)；与模型组比较，GB中、高剂量组和VPA组大鼠海马神经元凋亡数量明显减少，AI分别为(24.01±4.73)%、(14.39±2.84)%、(17.74±3.08)%，均明显低于模型组(P<0.01)；GB低剂量组AI为(39.47±7.62)%，明显高于GB中、高剂量组和VPA组(P<0.01)；GB高剂量组和VPA组AI明显低于GB中剂量组(P<0.01)；GB高剂量组AI明显低于VPA组(P<0.05)。见图2。

3.4 各组大鼠海马组织SOD、CAT活力和MDA含量比较

与空白对照组比较，模型组大鼠海马组织SOD、CAT活力降低，MDA含量升高，差异有统计学意义(P<0.01)。各给药组与模型组组间上述指标比较结果见表2。

3.5 各组大鼠海马组织Nrf2、HO-1、NF-κB、Caspase-3、Cleaved

Caspase-3蛋白表达比较与空白对照组比较，模型组大鼠海马组织Nrf2、HO-1表达下调，NF-κB、Cleaved Caspase-3表达上调，Cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。各组上述指标表达见图3，各给药组与模型组组间上述指标比较结果见表3。

4、讨论

EP是一种慢性神经系统疾病，长期反复发作严重影响患者的身心健康。大部分患者经药物治疗能够有效控制EP发作，但仍有约30%的患者疗效不佳而逐渐发展为难治性EP。EP发病机制尚未完全阐明，有研究证实氧化应激反应和继发性神经元凋亡是EP发作和神经退行性变的核心环节[3]。因此，寻找靶向抑制氧化应激和细胞凋亡的新型药物或许是改善EP患者预后的有效途径。

GB是从中药银杏叶中提取出的一种小分子活性单体化合物，具有抗氧化、抗凋亡等药理学作用，较易通过血脑屏障，WANGL等[7]研究发现GB能够通过抑制氧化应激反应和神经元凋亡减轻大鼠缺血性脑损伤。VPA是一种广泛应用于临床的广谱抗癫痫药，也是新型抗癫痫药研究动物实验的常用阳性对照药物。临床上以颞叶癫痫最为常见，EP实验动物模型的制备方法主要有电点燃和化学点燃两大类，其中氯化锂-匹罗卡品化学点燃法制备的EP大鼠模型为颞叶癫痫，与人类EP病理特点一致，并且操作简便、重复性高，是最公认的EP大鼠模型制作方法[12]。本实验采用氯化锂-匹罗卡品诱导制备EP大鼠模型，以VPA作为阳性对照药物，发现经GB干预能够明显延长EP大鼠EP发作潜伏期，缩短发作持续时间，降低EP发作程度，明显改善EP大鼠海马神经元病变，抑制海马神经元凋亡，GB低、中、高剂量对EP发作潜伏期、发作持续时间、发作程度及海马神经元凋亡的影响具有剂量依赖性，且GB高剂量上述效应优于VPA，提示GB对EP大鼠具有抗痫和脑组织保护作用。

活性氧自由基(reactiveoxygenspecies，ROS)代谢失衡是导致机体氧化应激损伤的基础。EP发作时神经元过度兴奋和异常放电导致ROS大量生成与释放[13]。以ROS为底物的抗氧化酶(SOD、CAT)被过度消耗致使ROS过剩，ROS攻击破坏核酸、蛋白质及生物膜脂质发生氧化应激反应，生成具有生物毒性的MDA，因此SOD、CAT活力和MDA含量能够反映机体氧化应激反应程度[14]。本研究结果表明，经GB干预能够明显提高EP大鼠海马组织SOD、CAT活力并降低MDA含量，GB低、中、高剂量对SOD活力和MDA含量的调控作用具有剂量依赖性，且GB高剂量对SOD活力和MDA含量的调控作用优于VPA，提示GB对EP大鼠氧化应激损伤具有抑制作用。

Nrf2是一种对机体氧化应激反应具有重要调控作用的核转录因子。DESHMUKHP等[15]研究发现，ROS能够诱导Nrf2与抑制剂Keap1解离而活化，核转位并激活抗氧化反应元件，促进抗氧化酶(SOD、CAT等)转录与表达。HO-1为Nrf2下游基因，Nrf2核转位后能够诱导HO-1转录表达而催化降解血红素、一氧化碳等，从而抑制氧化应激损伤[16,17]。细胞凋亡过程由多种基因参与调控，其中Caspase-3被剪切活化(ClevedCaspase-3)后参与细胞凋亡的启动与执行全过程，被认为是细胞凋亡最关键的调控因子[18]。翟春梅等[19]研究发现NF-κB能够诱导Caspase-3表达与活化，HO-1能够抑制NF-κB启动子IKKβ磷酸化进而抑制NF-κB活性[20]。本研究发现，GB能够明显上调EP大鼠海马组织Nrf2、HO-1表达并下调NF-κB、CleavedCaspase-3表达，降低CleavedCaspase-3/Caspase-3比值，GB低、中、高剂量对Nrf2、HO-1、NF-κB、CleavedCaspase-3表达及CleavedCaspase-3/Caspase-3比值的影响具有剂量依赖性，且GB高剂量组上述效应优于VPA组，提示GB对EP大鼠氧化应激和细胞凋亡的抑制作用可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。

综上所述，GB对EP大鼠具有抗痫和脑组织保护作用，其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路进而抑制氧化应激和细胞凋亡有关。下一步本课题组拟研究EP大鼠血脑屏障损伤机制及GB的干预作用，以进一步揭示GB治疗EP的药理机制。

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