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短梗菝葜乙酸乙酯部位抗肿瘤活性谱效关系

2021-12-17 87 上传者：管理员

摘要：目的建立短梗菝葜乙酸乙酯部位抗肿瘤活性谱效关系。方法以SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞为供试细胞,采用MTT法对短梗菝葜不同提取部位进行体外抗肿瘤活性筛选,利用偏最小二乘回归法对其HPLC指纹图谱与抗MGC80-3细胞作用之间的谱效关系进行分析。结果短梗菝葜乙酸乙酯部位对3种细胞均有不同程度的抑制作用,IC50分别为47.71、71.98、27.87μg/mL,对MGC80-3细胞的效果最为明显。活性部位指纹图谱中共有峰有22个,其中13个与药效呈正相关,9个呈负相关,X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21为主要药效峰。结论短梗菝葜乙酸乙酯部位对MGC80-3细胞有较强的抑制作用,提取物中多种成分与抗肿瘤作用具有相关性。

关键词：
MTT法
偏最小二乘法回归法
抗肿瘤活性
短梗菝葜
谱效关系
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短梗菝葜(SmilaxscobinicaulisC.H.Wright),又名黑刺菝葜，其根及根茎入药，在我国北方作为铁丝灵仙药用也已有多年历史，具有祛风除湿、活血通络、解毒散结等功效，临床用于治疗风湿痹痛，关节不利、疮疖、肿毒、瘰疬、癌症等功效[1,2,3]。从短梗菝葜正丁醇部位中提取分离出少数甾体皂苷类单体成分具有体外抗肿瘤活性[2],但关于短梗菝葜更多抗肿瘤活性成分的筛选研究较少，且未阐明其作用的物质基础。

中药材种类多，成分复杂，其功效是多种化学成分共同作用的结果，中药指纹图谱是对中药整体的化学成分组成的质量控制，与中药的功效没有直接的内在联系，而建立中药指纹图谱谱效关系，将指纹图谱中化学成分的变化与药效结合，可更好的对中药的质量控制和药效评价[4]。

对短梗菝葜不同提取部位，采用MTT法，考察各部位对人肝癌SMMC-7721细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人胃癌MGC80-3细胞存活率影响，并确定其抗肿瘤活性部位；建立活性部位指纹图谱，通过指纹图谱特征与药效的之间的相关性，并运用偏最小二乘法，构建谱效关系，初步确定具体发挥药效的物质基础，为短梗菝葜质量控制和临床应用提供一定的参考依据。

1、材料

1.1 药材

短梗菝葜产地见表1,经河南中医药大学苏秀红教授鉴定为百合科菝葜属短梗菝葜SmilaxscobinicaulisC.H.Wright的根及根茎。

1.2 细胞

人肝癌SMMC-7721细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人胃癌MGC80-3细胞，由河南中医药大学药理实验室馈赠。

1.3 仪器

e2695-2489型高效液相色谱仪(美国Waters公司);MS105DU电子分析天平(万分之一，瑞士梅特勒-托利多公司);VARIOSKANLUX型自动酶标仪(美国赛默飞世尔公司);AE2000倒置显微镜(德国Motic公司);371型CO2恒温培养箱(美国ThermoFisherScilentific公司);EYELAN-1100旋转蒸发仪、FDU-1200型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)。

1.4 试剂

胎牛血清(批号SA190501)、MEM培养基(批号WH0111201911SP)(武汉普诺赛生命科技有限公司);RPMI-1640培养基(批号20191129)、噻唑蓝(MTT,批号725C0511)、DMSO(批号11001G031)、0.25%胰酶(批号20150302)、青霉素-链霉素混合液(双抗)(批号20190712)(北京索莱宝科技有限公司)。白藜芦醇(纯度≥98%)。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

2、方法

2.1 抗肿瘤活性部位筛选

2.1.1 样品制备

称取药材粉末(S1,过四号筛)100g,加入70%乙醇，在料液比1∶10条件下回流提取3次，每次1.5h,冷却，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，得到乙醇总提物，蒸干后加200mL热水，取1/5作为乙醇总提取液，剩余4/5依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取至近无色为止，减压回收各部位萃取液，浸膏加适量水成混悬液，置于超低温冰箱中保存3d,放置冷冻干燥机中1d,得到乙醇总提物(得率0.519%)、石油醚部位(得率0.159%)、乙酸乙酯部位(得率1.27%)、正丁醇部位(得率2.812%)、剩余液(得率1.672%),加入DMSO至0.1g/mL,临用前用培养基稀释成不同质量浓度的供试液，所含DMSO的体积分数不超过千分之一。

2.1.2 细胞培养

在5%CO2、37℃下，用含10%胎牛血清的MEM培养基传代培养SMMC-7721细胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基传代培养A549、MGC80-3细胞。

2.1.3 MTT法

参考文献[5,6,7,8]报道，将处于对数生长期的SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞用0.25%胰酶消化成细胞悬液，调整细胞密度为5×104个/mL,接种于96孔板中，每孔100μL,置于CO2培养箱中培养24h后，吸弃原培养液，加入含不同质量浓度药物的培养基，每种药物设5个，分别为12.5、25、50、75、100μg/mL,每孔100μL,每个质量浓度设3个复孔，同时设立对照组，只加入等体积的无血清培养基。于给药48h后，每孔加入20μL5mg/mLMTT溶液，混匀后置于CO2培养箱中继续孵育4h,吸弃各孔中上清液，加入150μLDMSO,振荡混匀15min,待其各孔中的紫色结晶完全溶解后置于自动酶标仪中，测定各孔光密度(OD值，波长490nm),重复3次，计算细胞存活率，细胞存活率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

2.1.4 统计学分析

通过SPSS20.0软件进行处理，计量资料以(x¯±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。采用Graphpadprism5软件绘图。

2.2 HPLC指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件

ZORBAXSBC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相乙腈(A)-水(B),梯度洗脱(0～15min,5%～10%A;15～35min,10%～15%A;35～55min,15%～20%A;55～90min,20%～30%A;90～105min,30%～33%A);体积流量1mL/min;柱温30℃;检测波长330nm;进样量10μL。

2.2.2 对照品溶液制备

精密称取白藜芦醇适量，加甲醇溶解，即得。

2.2.3 供试品溶液制备

按“2.1.1”项下方法制备乙酸乙酯部位，称取10mg,定容至2mL量瓶中，0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.4 方法学考察

2.2.4.1 精密度试验

精密吸取同一份供试品溶液(S1),在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6次，以10号峰白藜芦醇为参照，测得22个共有峰相对保留时间RSD均小于2%,相对峰面积RSD均小于5%,表明仪器精密度良好。

2.2.4.2 重复性试验

精密称取同一批药材粉末6份(S1),按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以10号峰白藜芦醇为参照，测得22个共有峰相对保留时间RSD均小于2%,相对峰面积RSD均小于5%,表明该方法重复性良好。

2.2.4.3 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液(S1),于0、4、8、12、16、24h在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，以10号峰白藜芦醇为参照，测得22个共有峰相对保留时间RSD均小于2%,相对峰面积RSD均小于5%,表明溶液在24h内稳定性良好。

2.3 乙酸乙酯部位对MGC80-3细胞存活率的影响

按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，得到乙酸乙酯部位(100μg/mL),采用MTT法测定它对人胃癌MGC80-3细胞的存活率。

2.4 谱效关系研究

采用偏最小二乘法进行相关性分析，以指纹图谱中各共有峰的峰面积为自变量X,MGC80-3肿瘤细胞存活率为因变量Y,通过SIMCA-P13.0软件对其进行偏最小二乘回归分析，建立回归方程。

3、结果

3.1 不同提取部位对细胞存活率的影响

3.1.1 SMMC-7721细胞

石油醚、乙酸乙酯部位对SMMC-7721细胞存活率均具有不同程度的抑制作用，与对照品比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2,IC50值分别为84.47、47.71μg/mL,见表3。其中，乙酸乙酯部位抑制作用最强，乙醇提取物和剩余物均无抑制作用，正丁醇部位反而可促进其增殖，见图1。

3.1.2 A549细胞

不同提取部位对A549细胞的存活率与对照品比较，差异有统计学意义(P<0.01),见表2。乙酸乙酯部位具有明显的抑制作用，IC50值为71.98μg/mL,最大抑制浓度为100μg/mL,细胞存活率为40.05%,呈量效关系；乙醇提取物、正丁醇部位、剩余物均无抑制作用或促进其增殖，见图1。

3.1.3 MGC80-3细胞

不同提取部位对MGC80-3细胞存活率均具有不同程度的抑制作用，与对照品比较差异有统计学意义(P<0.01),见表2。细胞存活率均在80%以下，乙酸乙酯部位具有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，IC50为27.87μg/mL,见表3。乙醇提取物、石油醚部位、正丁醇部位和剩余液对该细胞的抑制作用及变化不明显，均未达到50%,见图1。

3.1.4 小结

乙酸乙酯部位对MGC80-3细胞较敏感，抑制作用较强，最大抑制浓度为100μg/mL,故选择其进行后续实验。

3.2 图谱生成

按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液制备10批样品的供试品溶液，各取10μL,在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，将相关数据导入中药指纹图谱相似度评价系统软件(2012.130723版本),设置S1图谱为参照，采用中位数法，时间窗宽度为0.1,得到指纹图谱(图2),确定22个共有峰，以10号峰白藜芦醇为参照，发现各共有峰相对保留时间一致，但相对峰面积RSD、峰面积值差异较大，表明不同产地药材主要成分含量具有一定差异，见表4～5。除S3、S5外，其他8批药材相似度均在0.9以上，见表6。

3.3 对MGC80-3细胞存活率的影响

10批样品乙酸乙酯部位均有较好抑制肿瘤的作用，与对照品比较差异有统计学意义(P<0.01),以S1最强，见表7。

3.4 谱效关系研究

3.4.1 偏最小二乘回归方程

通过SIMCA-P13.0软件进行偏最小二乘回归分析[9,10,11],得方程为Y=0.1773X1+0.2958X2+0.0352X3-0.2174X4-0.1737X5+0.0160X6+0.4654X7+0.3428X8-0.0164X9+0.0341X10+0.1505X11+0.1787X12-0.3522X13+0.0978X16-0.1487X17-0.0605X18-0.3001X19-0.0364X20-0.4212X21-0.1239X22,回归系数见图3。由此可知，峰1、2、3、6、7、8、10、11、12、14、15、16、20与药效呈正相关，贡献度依次为为7>8>15>2>12>1>11>16>20>3>10>6;峰4、5、9、13、17、18、19、21、22与药效呈负相关，贡献度依次为21>13>19>4>5>17>22>18>9>14。

3.4.2 变量重要性

变量投影重要性(VIP值)分析结果见图4,可知X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21的VIP值大于1,依次为X21>X7>X1>X19>X18>X4>X2、X17>X13,其中X1、X2、X7与药效呈正相关，VIP值也较大，而X4、X13、X17、X18、X19、X21与药效呈负相关；R2X=0.918,R2X=1,Q2=0.734,表明该模型拟合解释、模型预测能力较强。

4、讨论

本实验以SMMC-7721、A549、MGC80-3细胞为筛选模型，以抗肿瘤活性为指标，对短梗菝葜不同提取部位进行抗肿瘤活性筛选，结果抗肿瘤活性物质主要存在于乙酸乙酯部位，对3种肿瘤细胞均具有抑制作用，但不同肿瘤细胞株对同一药物的敏感性不同，最佳细胞敏感株为MGC80-3细胞。张莲萍等[12]从同属植物“菝葜”中提取分离出的白藜芦醇、β-谷甾醇、槲皮素、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷等化学成分，具有较好的抗肿瘤活性；而张存莉等[13]发现短梗菝葜乙酸乙酯部位中也具有上述化学成分；本研究也发现乙酸乙酯部位具有较强的抗肿瘤活性，可能与该部位中的这些成分有关。正丁醇部位却具有促进肿瘤细胞增殖的作用，而许静等[2]从正丁醇部位分离出的仅有少数甾体皂苷类单体成分具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，大部分则无抑制肿瘤作用；可能与本实验提取的正丁醇部位为粗提物有关，粗提物中含有多种化学成分，化学成分之间相互拮抗或协同作用，而影响抗肿瘤活性；乙醇总提物和剩余液几乎无抑制肿瘤细胞增殖的作用。本实验初步确定了短梗菝葜乙酸乙酯部位为主要的抗肿瘤活性部位，但抗肿瘤的活性成分有待进一步的分离纯化，并更深入的研究其抗肿瘤的作用机制。

在倒置显微镜下观察各提取部位给药后SMMC-7721、A549和MGC80-3细胞形态及细胞数目的变化，发现乙酸乙酯部位给药前细胞贴壁性好，细胞伸展开，饱满，增殖旺盛，经不同浓度给药48h后，细胞形态变为圆形，甚至破碎，皱缩，细胞间隙增大，引起肿瘤细胞发生凋亡或坏死，同时发现随着药物浓度的不断增大，细胞凋亡率也逐渐增大；正丁醇部位细胞形态无明显变化，但随着药物浓度的增大，细胞数量明显增加，因而促进了肿瘤细胞的增殖，但采用乙醇总提物、乙醚部位及剩余液给药后细胞形态及数目则无明显的变化。

在指纹图谱相似度评价中，济源市思礼镇九里沟郑坪村郭庄(S3)和安阳市林州石板岩镇红土岗(S5)产地的相似度分别为0.864和0.75,相似度较低原因是可能与化学成分含量的差异相关；而引起化学成分的差异又与气候和地理因素等相关。贺建武等[14]研究发现，相对湿度、年降水量和年最低温等是影响菝葜主要药效成分的主导因子，年最低温、年均温和≥10℃有效积温与菝葜药效成分呈正相关，相对湿度、年降水量和无霜期与菝葜药效成分呈负相关。如济源市思礼镇九里沟郭庄(S3)的峰面积与其他产地比较，X1、X3、X7、X8、X9、X10的峰面积较小，可能与相对湿度、年降水量和无霜期有关，而导致含量较低；安阳市林州石板岩镇红土岗(S5)的峰面积与其他产地比较，X2、X4、X5、X6、X8、X9、X10、X11、X13、X15、X16的峰面积较大，可能与年最低温、年均温和≥10℃有效积温等有关，而导致含量较高。

偏最小二乘回归法是集多因变量对多自变量的回归建模以及多元线性回归分析、主成分分析、典型相关分析功能为一体的多元数据分析方法，能消除自变量之间的多重相关性，辨识系统中的信息与噪声，更好的体现中药成分与药效之间的相关性，是构建中药谱效关系的一种有效方法。本实验采用偏最小二乘法建立短梗菝葜乙酸乙酯部位谱效方程，结果显示各成分均对MGC80-3细胞存活率有影响，其中9个成分对药效的影响较大，分别X1、X2、X4、X7、X13、X17、X18、X19、X21,说明其抗肿瘤作用取决于多种化学物质共同作用的结果；X21在指纹图谱中含量较低，且在偏最小二乘中与药效呈负相关，是发挥主要作用的药效物质，而X10为白藜芦醇，含量较高，与药效呈正相关，却不是发挥药效的关键物质，可见中药化学成分的复杂性。由于有关短梗菝葜化学成分文献报道较少，故无法指认与其对应的化合物，后续研究中有待分离纯化活性成分并进行鉴定。

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