自2008年A6型柯萨奇病毒（CV-A6）首次引起手足口病（HFMD）暴发流行以来，CV-A6感染致HFMD发病率呈上升趋势，并成为部分地区的主要流行株[1,2,3]。但是，国内外对HFMD病原体的研究主要集中于肠道病毒71型（EV71）和CV-A16，围绕CV-A6的相关研究匮乏，对于抗CV-A6药物的研究迫在眉睫。

清热解毒类中药制剂在病毒性感染疾病的治疗上不仅能抗病毒、消炎、退热，还能提高人体免疫力，具有多靶点治疗、整体调节的特点[4,5]。银花青蒿栀子方（YQZ）源于名老中医经验方，组方为金银花3～15g、青蒿6～25g和栀子3～12g，具有清热解毒、疏风解表之功效[6]。近年来，研究发现该方开发的中药制剂对甲型H1N1流感病毒、新型冠状病毒及肠道病毒EV71和CV-A16等均有一定程度的抑制作用[7,8,9]。

基于前期研究发现YQZ具有抗CV-A6作用，本研究以活性追踪为主线，将YQZ醇提物进行分离和结构鉴定，并采用分子对接技术分析活性成分和病毒靶点蛋白之间的相互作用，以期明确YQZ抗CV-A6的活性成分，并为后期作用机制研究和制剂制备、质量控制及药动学研究提供目标成分。

1、材料与仪器

1.1 病毒和细胞

CV-A6引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所毒种室；人横纹肌瘤RD细胞，引自中国预防医学研究所病毒研究室。

1.2 药材

金银花（批号20170306）、青蒿（批号20170306）、栀子（批号20170306）均购自泰安市金泰联药店，经泰山医学院高红莉教授鉴定分别为忍冬科忍冬属植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾、菊科蒿属植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.的干燥地上部分、茜草科栀子属植物栀子GardeniajasminoidesElis的干燥果实。

1.3 试剂

MEM培养基（Gbico公司，批号10098-143）；胎牛血清（Gbico公司，批号10098-143);CCK-8（联科生物，批号6366831）；柱色谱硅胶（200～300目，国药集团化学试剂有限公司）；D101大孔树脂（天津海光化工有限公司）；聚酰胺（国药集团化学试剂有限公司）；SephadexLH-20凝胶（GE公司）；利巴韦林（ribavirin,RBV，中国食品药品检定研究院，批号140629-201713）。

1.4 仪器

植物粉碎机FW-177型（天津市泰新特仪器有限公司）；KQ-100DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；生物安全柜（ThermoFisherScientific）；二氧化碳恒温培养箱（ThermoFisherScientific）；倒置显微镜（尼康株式会社）；InfiniteM200Pro酶标仪（Tecan公司）；VarianMercury-Plus400MHz型核磁共振仪（美国Varian公司）。

2、方法

2.1 提取与分离

按3∶15∶2比例称取金银花、青蒿、栀子粗粉共计6.0kg，加入8倍量75%乙醇浸泡2h，室温超声提取2次，每次20min。合并提取液，40℃减压回收乙醇得粗提液，依次用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取得石油醚部位（petroleumetherextract,PEE）、醋酸乙酯部位（ethylacetateextract,EAE）、正丁醇部位（n-butanolextract,BE）和水部位（waterextract,WE）。

采用硅胶柱色谱法分离PEE(100g），以石油醚-醋酸乙酯（10∶0→7∶3）梯度洗脱，TLC分析合并得11个组分Fr.1～11。组分Fr.8和Fr.10具有抗病毒活性，采用硅胶柱色谱法分离。组分Fr.8(1.17g）以石油醚-醋酸乙酯（95∶5→90∶10）梯度洗脱，合并相同组分，其中Fr.8-2出现结晶，经石油醚重结晶得化合物1(23.1mg）。组分Fr.10(2.63g）以石油醚-醋酸乙酯（90∶10→80∶20）梯度洗脱，合并相同组分，其中Fr.10-3出现结晶，经丙酮重结晶得化合物2(35.7mg）。

采用硅胶柱色谱法分离EAE(166g），以二氯甲烷-甲醇（10∶0→7∶3）梯度洗脱，TLC分析合并得9个组分Fr.1～9。其中，Fr.3、Fr.5和Fr.9具有抗CV-A6活性，Fr.3活性小，Fr.9与BE的成分相似，对Fr.5进行分离。采用硅胶柱色谱法分离Fr.5(11.2g），以二氯甲烷-甲醇（95∶5→80∶20）梯度洗脱，得组分Fr.5-1～5-5。组分Fr.5-4具有抗病毒活性，采用SephadexLH-20凝胶柱、以甲醇为洗脱液进行分离，得化合物3(19.0mg）。

BE(175g）经D-101大孔吸附树脂依次用水及30%、60%、95%乙醇溶液洗脱，继续分离30%乙醇洗脱物（Fr.1）和60%乙醇洗脱物（Fr.2）。Fr.1(39g）采用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（90∶10→80∶20）梯度洗脱，得到5个组分Fr.1-1～1-5。Fr.1-2经醋酸乙酯重结晶得到化合物4(1.1g),Fr.1-4经甲醇重结晶得到化合物5(0.2g）。Fr.2(75g）采用聚酰胺柱色谱分离，以50→75%乙醇梯度洗脱，合并相同组分，Fr.2-2经95%乙醇重结晶得化合物6(36.0mg）。

2.2 细胞毒性测定

在96孔板接种5×104/mL的RD细胞，每孔100μL。细胞形成单层后，将PEE、EAE和BE分离得到组分和单体分别加二甲亚砜和PBS溶解，再用维持液进行倍比稀释，接种于细胞，每孔100μL。置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中孵育48h，正常细胞对照组加入同体积维持液。采用CCK8法测定波长450nm的吸光度（A）值，计算细胞存活率，Probit回归法确定半数毒性浓度（mediantoxicconcentration,TC50）和最大无毒浓度（maximalatoxicconcentration,TC0）。

2.3 抗病毒活性测定

在96孔板接种RD细胞，37℃、5%CO2培养箱中培养24h，弃液。将药液和病毒液1∶1混合，加到细胞中，每孔100μL[药物浓度=TC0，感染复数（MOI)=1]。正常对照组加入同体积维持液，模型组加入维持液和病毒液的1∶1混合液，阳性对照组加入RBV溶液（200μg/mL）和病毒液的1∶1混合液。置于37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养1h。弃液，加维持液继续孵育至48h。显微镜下观察CPE,CCK8法测定细胞存活率，计算病毒抑制率。

2.4 统计学处理

采用GraphPadPrism5软件进行数据处理分析，组间数据进行单因素方差分析，数据用表示，以P<0.05为差别有统计学意义，P<0.01表示显著性差异。

2.5 活性成分与病毒靶点蛋白之间的相互作用

通过药物设计软件DiscoveryStudio2017R2进行病毒蛋白靶点和潜在目标化合物的分子对接，对化合物和蛋白之间的相互作用进行分析。从蛋白质结构数据库（ProteinDataBank,PDB）中下载标记为5YHQ的CV-A6病毒样颗粒结构（virus-likeparticle,VLP），选择衣壳蛋白VP1作为靶点蛋白。VP1的surface-exposedloops和C端结构是主要的免疫原性位点[10]，作为分子对接的结合部位。对接前将靶点蛋白进行去水、加氢处理，将化合物的二维结构转变成三维结构，作为配体与受体蛋白进行对接。

3、实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色结晶（石油醚）。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.42(1H,s,12-COOH),6.17(1H,brs,H-1),5.40(1H,brs,H-13),4.94(1H,brs,H-13),2.71(1H,d,J=12.0Hz,H-3),2.59(1H,d,J=12.0Hz,H-3),1.94(1H,d,J=12.0Hz,H-10),1.86(1H,d,J=6.0Hz,H-5),1.75(1H,d,J=12.0Hz,H-4),1.69(1H,d,J=12.0Hz,H-8),1.66(1H,m,H-9),1.53(1H,dd,J=14.1,7.8Hz,H-6),1.40(1H,m,H-8),1.56(3H,s,H-14),1.33(1H,d,J=8.2Hz,H-4),1.27(1H,dd,J=12.5,3.1Hz,H-7),1.03(1H,dd,J=11.6,3.4Hz,H-7),0.87(3H,d,J=5.8Hz,H-15);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:173.3(C-12),148.8(C-2),139.4(C-11),128.7(C-1),125.3(C-13),46.9(C-10),46.1(C-9),42.6(C-5),39.9(C-6),32.4(C-4),31.1(C-8),30.7(C-3),30.4(C-7),28.8(C-14),24.8(C-15)。以上数据与文献对比基本一致[11]，故鉴定化合物1为青蒿酸。

化合物2：白色针状结晶（丙酮）；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.13(1H,s,H-5),3.16(1H,dd,J=7.1,5.5Hz,H-11),2.26(1H,m,H-3α),2.05(1H,dd,J=17.4,4.1Hz,H-3ß),1.93(1H,dd,J=7.1,3.9Hz,H-2α),1.72(1H,m,H-8α),1.64(1H,dd,J=13.0,3.3Hz,H-9ß),1.50(1H,m,H-10),1.36(3H,s,H-15),1.32(1H,m,H-2ß),1.29(1H,m,H-1),1.15(1H,dd,J=13.1,2.9Hz,H-8ß),1.07(3H,d,J=7.3Hz,H-13),0.92(3H,d,J=6.3Hz,H-14);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:172.0(C-12),105.2(C-4),93.8(C-5),80.1(C-6),50.0(C-1),44.4(C-7),36.6(C-10),36.0(C-3),33.6(C-9),33.0(C-11),25.4(C-15),24.9(C-2),22.9(C-8),20.1(C-14),12.9(C-13)。以上数据与文献对比基本一致[12]，故鉴定化合物2为青蒿素。

化合物3：黄色结晶（甲醇）。1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.98(1H,s,5-OH),10.08(3H,brs,7,3′,4′-OH),7.43(1H,dd,J=2.0,8.0Hz,H-6′),7.41(1H,d,J=2.0Hz,H-2′),6.90(1H,d,J=8.1Hz,H-5′),6.67(1H,s,H-3),6.45(1H,d,J=2.1Hz,H-8),6.20(1H,d,J=2.0Hz,H-6);13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:182.1(C-4),164.6(C-7),164.3(C-2),162.7(C-9),161.9(C-5),157.7(C-4′),150.1(C-3′),121.9(C-6′),119.4(C-1′),116.5(C-5′),113.8(C-2′),104.1(C-10),103.3(C-3),99.3(C-6),94.3(C-8)。以上数据与文献对比基本一致[13]，故鉴定化合物3为木犀草素。

化合物4：白色结晶性粉末；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.47(1H,d,J=0.9Hz,H-3),6.09(1H,dd,J=5.6,3.0Hz,H-6),5.68(1H,d,J=3.0Hz,H-7),5.12(1H,d,J=6.9Hz,H-1),4.53(1H,d,J=7.9Hz,H-1');13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:167.3(C-11),152.0(C-3),144.5(C-8),125.9(C-7),111.4(C-4),99.0(C-1′),96.2(C-1),77.7(C-3′),77.1(C-5′),73.7(C-2′),70.4(C-4′),61.4(C-6′),59.8(C-10),51.5(-OCH3),46.3(C-9),38.4(C-6),34.9(C-5)。以上数据与文献对比基本一致[14]，故鉴定化合物4为栀子苷。

化合物5：白色粉末；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.40(1H,s,5′-COOH),9.57(1H,s,4-OH),9.13(1H,s,3-OH),7.44(1H,d,J=15.9Hz,H-7),7.04(1H,d,J=1.7Hz,H-2),6.98(1H,dd,J=8.2,2.1Hz,H-6),6.76(1H,d,J=8.1Hz,H-5),6.13(1H,d,J=15.9Hz,H-8),5.07(1H,m,H-1′),3.93(1H,m,H-2′),3.57(1H,m,H-3′),2.02～1.97(4H,m,H-4′,6′)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:175.3(C-7),166.1(C-9′),148.8(C-4′),146.0(C-3′),145.4(C-7′),126.0(C-1′),121.8(C-6′),116.2(C-5′),115.2(C-2′),114.7(C-8′),73.9(C-3),71.3(C-4),70.8(C-5),68.5(C-1),37.6(C-6),36.7(C-2)。以上数据与文献对比基本一致[15]，故鉴定化合物5为绿原酸。

化合物6：黄色粉末；1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.98(1H,s,5-OH),7.62～7.44(1H,m,H-6′),7.43(1H,d,J=2.1Hz,H-2′),6.91(1H,d,J=8.3Hz,H-5′),6.79(1H,d,J=2.1Hz,H-6),6.75(1H,s,H-3),6.45(1H,d,J=2.1Hz,H-8),5.09(2H,d,J=7.3Hz,H-1″),3.18～3.72(4H,m,H-2″～5″)；13C-NMR(100MHz,CDCl3)δ:182.3(C-4),164.9(C-2),163.4(C-7),161.6(C-5),157.4(C-9),150.4(C-4′),146.2(C-3′),121.8(C-1′),119.6(C-6'),116.4(C-5′),114.0(C-2′),105.8(C-10),103.6(C-3),100.3(C-6),100.0(C-8),95.2(C-1″),77.6(C-5″),76.8(C-3″),73.6(C-2″),70.0(C-4″),61.1(C-6″)。以上数据与文献对比基本一致[16]，故鉴定化合物6为木犀草苷。

3.2 细胞毒性研究

YQZ醇提物的各萃取部位及分离得到的组分和单体对RD细胞的TC50和TC0见表1。

3.3 抗病毒活性研究

YQZ醇提物的PEE、EAE和BE体外对CV-A6的抑制率均大于对照RBV,PEE和对照组之间存在显著性差异（P<0.05),WE无活性。PEE分离得到的组分Fr.8、Fr.10和分离得到的化合物1（青蒿酸）和2（青蒿素）对CV-A6的抑制率显著高于RBV(P<0.05、0.01）。EAE中分离得到组分Fr.5及其分离得到的Fr.5-4病毒抑制率高于RBV，分离得到的化合物3（木犀草素）活性较低。BE分离得到的Fr.1及化合物4（栀子苷）、5（绿原酸）和6（木犀草苷）对CV-A6的抑制率显著高于对照RBV(P<0.01）。见图1。

3.4 活性成分与病毒靶点蛋白之间的相互作用

活性成分作为配体与受体蛋白VP1进行分子对接，相关参数见表2。表2中各成分和靶蛋白分子对接的绝对自由能和LibDock得分均较高，说明其与蛋白结合紧密。分子对接的二维和三维结构示意图见图2。

由图2可见，绿原酸分子和VP1蛋白的ASN、TYR等6个氨基酸残基之间存在氢键作用，栀子苷分子与MET、ASP等7个氨基酸之间形成氢键，亲和力强。青蒿酸分子和氨基酸ARG、GLU之间形成氢键，和ASP、TYR等多个残基之间存在范德华引力。木犀草苷分子与ASN、CYS等5个氨基酸之间存在氢键作用，同时与其他氨基酸存在碳氢键、范德华引力、Pi-Sulfur等相互作用。上述成分分子与氨基酸残基之间的相互作用使二者具有良好的亲和力，使其起到抑制VP1蛋白的作用。

4、讨论

中药药效物质基础是指中药发挥治疗作用的化学成分（群）[17]，明确药效物质基础是阐明中药作用机制的关键，是优化制剂处方工艺的依据，是保证质量控制具有科学性的核心，是实现中药现代化和国际化的重要研究内容[18,19,20]。本研究将YQZ醇提物采用萃取、硅胶柱色谱、大孔吸附树脂、凝胶柱色谱、聚酰胺柱色谱、重结晶等多种方式进行分离，通过测定分离产物的病毒抑制率进行活性追踪。结果表明YQZ醇提物的PEE、EAE和BE具有良好的抗CV-A6活性，WE基本无活性，这和前期研究中水提物和醇提物的体外抗病毒活性筛选结果是一致的。PEE和BE分别分离得到的青蒿酸和青蒿素、木犀草苷、绿原酸和栀子苷具有良好的抗CV-A6活性。

CV-A6属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属，病毒颗粒基因组编码的多聚蛋白水解为3个蛋白前体（P1～P3）。P1进一步水解为4个结构蛋白（VP1～VP4），共同构成病毒衣壳。VP4位于病毒衣壳内侧，VP1～VP3位于衣壳表面，是抗原决定簇存在的主要部位。其中，VP1的surface-exposedloops和C端结构是主要的免疫原性位点，作为分子对接的结合部位。分子对接结果表明，青蒿酸、青蒿素、绿原酸、栀子苷和木犀草苷分子均与CV-A6衣壳蛋白存在多个氢键、范德华引力等作用，生成稳定的复合物。因此，青蒿酸、青蒿素、绿原酸、栀子苷和木犀草苷成分是YQZ抗CV-A6的重要活性成分，其抗病毒作用可能与抑制衣壳蛋白有关。

近年来，清热解毒类中药及其活性成分的抗病毒作用和在治疗病毒感染性疾病中的应用得到广泛关注。研究结果表明，中药青蒿中的青蒿素及其衍生物具有抗病毒活性，其中青蒿素具有抑制巨细胞病毒、单纯疱疹病毒（HSV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒等多种病毒的作用[21,22]。中药栀子和金银花均为常用清热解毒药，栀子中的主要成分栀子苷具有抗甲型H1N1流感病毒和EV71活性[23,24]；绿原酸为金银花的主要成分之一，对EV71、腺病毒、HBV、HSV等多种病毒具有抑制作用[25,26]。迄今为止，尚未有上述活性成分抗CV-A6作用的报道。因此，对上述成分抗CV-A6的体内作用及其他作用机制值得进一步研究。

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文章来源：李菲,赵新亚,赵雪梅,毕研平,李娟,崔清华,田景振.银花青蒿栀子方抗A6型柯萨奇病毒活性成分的分离[J].中草药,2022,53(05):1365-1371.