首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 中药学论文 > 消退素D1对干燥综合征小鼠免疫调节的影响

消退素D1对干燥综合征小鼠免疫调节的影响

2022-04-29 84 上传者：管理员

摘要：目的探讨消退素D1（RvD1）对干燥综合征（SS）小鼠免疫调节的影响。方法20只非肥胖糖尿病（NOD）小鼠随机分为模型组和RvD1组，每组10只，另选10只Balb/c小鼠为对照组。8周后检测小鼠的饮水量、唾液量、颌下腺质量和体质量。检测小鼠血清白细胞介素（IL）-2、IL-4、IL-10和干扰素（IFN）-γ水平。流式细胞术检测血清辅助性T细胞（Th）1和Th2的表达。RT-PCR法检测颌下腺组织T-bet和GATA-3mRNA的表达量。结果与对照组比较，模型组小鼠饮水量明显升高，唾液量明显降低（P<0.05）；而与模型组比较，RvD1组小鼠饮水量明显降低，唾液量明显升高（P<0.05）。与对照组比较，模型组小鼠颌下腺质量与指数均明显降低（P<0.05）；与模型组比较，RvD1组小鼠颌下腺质量与指数均明显升高（P<0.05）。与对照组比较，模型组小鼠Th1细胞比例显著升高，Th2细胞比例降低（P<0.05）；与模型组比较，RvD1组小鼠Th1细胞的比例显著降低，Th2细胞的比例升高。与对照组相比，模型组小鼠IL-2和IFN-γ表达明显升高，IL-4和IL-10表达明显降低（P<0.05）；而与模型组相比，RvD1组小鼠血清IL-2和IFN-γ表达明显降低，IL-4和IL-10表达明显升高（P<0.05）。与对照组相比，模型组小鼠颌下腺组织T-betmRNA表达升高，而GATA-3mRNA表达降低（P<0.05）；而与模型组相比，RvD1组小鼠颌下腺组织T-betmRNA表达降低，而GATA-3mRNA表达升高（P<0.05）。结论RvD1可能通过调节Th1/Th2细胞平衡改善SS引起的炎症和组织损伤。

关键词：
Th1细胞
Th2细胞
免疫调节
干燥综合征
消退素
加入收藏

干燥综合征（SS）是一类常见的慢性炎症性自身免疫病，以为口干、眼干、关节痛主要临床表现，同时还可出现乏力、低热等全身症状[1,2]。尽管SS的发病机制尚未完全阐明，但一般认为免疫平衡紊乱与SS的发病密切相关[3]。研究表明，辅助性T细胞（helperTcells,Th)1和Th2介导的免疫失衡在SS的发生、发展中起重要的作用[4,5]。消退素D1(reslovinD1,RvD1）是一种由二十碳五烯酸衍生的内源性抗炎脂质分子，具有调节免疫和抗炎作用[6]。目前，RvD1已被证实在溃疡性结肠炎、类风湿性关节炎和自身免疫性脑炎等自身免疫性疾病中发挥保护作用[7,8]。然而，RvD1对于SS的作用鲜有报道。因此，本研究通过构建SS小鼠模型，探讨RvD1在SS发病中的作用及其潜在机制，以期为RvD1治疗SS提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 实验材料

SPF级雌性Balb/c和NOD小鼠，8周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。RvD1（纯度>98%）购自美国Sigma公司。白细胞介素（IL)-2、IL-4、IL-10和干扰素（IFN）-γ酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司。抗CD4抗体、抗IL-4抗体和抗IFN-γ抗体购自美国eBioscience公司。Th细胞刺激液混合套装由佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）/离子霉素、布雷菲德菌素（BFA）/莫能菌素组成，购自美国eBioscience公司。

1.2 SS模型建立与动物分组

利用随机数字表法，将20只非肥胖糖尿病小鼠（non-obesediabetes,NOD）小鼠分为模型组和RvD1组，每组各10只小鼠。另外选10只Balb/c小鼠为对照组。其中，RvD1组小鼠每天灌胃5mg/kgRvD1（溶于生理盐水，0.2ml），对照组和模型组小鼠每天灌胃等量生理盐水，连续用药8周。

1.3 小鼠饮水量和唾液量的测定

分别于每周同一时间测量各组小鼠的饮水量和唾液量。操作步骤如下：间隔24h测量小鼠饲养笼中水瓶的质量，其差值即为小鼠当日的总饮水量。利用湿质量法测量小鼠的唾液分泌量，即将小鼠麻醉后，将称质量后的脱脂棉球塞入小鼠口中，5min后取出棉球再次称质量，2次棉球质量之差即为小鼠在该时段内分泌的唾液量。

1.4 颌下腺质量与指数

实验结束后，称量小鼠体质量并处死，分离、摘取颌下腺，用无菌纸吸干颌下腺表面血迹，称量小鼠的颌下腺质量。颌下腺指数=颌下腺质量（mg）/体质量（g），计算小鼠的颌下腺指数。

1.5 RT-PCR法检测

取适量颌下腺组织，加入1mlTRIzol以提取总RNA，紫外分光光度计测定总RNA的浓度。利用模板将总RNA逆转录成cDNA，利用RT-PCR法，以β-action作为内参，检测T-bet和GATA-3的表达。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成：β-action(97bp），上游引物序列:5'-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3'，下游引物序列:5'-GCAGAGCAGTAATCTCCTTC-3';T-bet(384bp），上游引物序列：5'-ATGTTTGTGGATGTGGTCTTGGTG-3'，下游引物序列:5'-CTGAGTGATCTCTGCGTTCTGGTAG-3';GATA-3(465bp），上游引物序列：5'-CAGAAGGCAGGGAGTGTGTGAA-3'，下游引物序列：5'-TGGAGTGGCTGAAGGGAGAG-3'。

1.6 血清学检测

心脏穿刺法收集小鼠外周血，离心15min后获得血清。按照ELISA试剂盒说明书操作，检测小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ含量。

1.7 流式细胞术检测

采集新鲜抗凝血500μl，离心15min后弃上清，加入红细胞裂解液重悬细胞，裂解5min后置于离心机中离心5min。弃上清，加入PBS重悬细胞，按1ml细胞液加入2μlTh细胞刺激液的比例孵育4～6h后弃去上清。分别加入抗CD4抗体、抗IL-4抗体和抗IFN-γ抗体，避光孵育15min,PBS重悬细胞后置于流式细胞仪中进行检测。其中，CD4+IFN-γ+标记Th1细胞，CD4+IL-4+标记Th2细胞。

1.8 统计学分析

利用SPSS21.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 饮水量和唾液量比较

与对照组比较，模型组小鼠饮水量明显升高，唾液量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而与模型组比较，RvD1组小鼠饮水量明显降低，唾液量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2 颌下腺质量与指数比较

与对照组比较，模型组小鼠颌下腺质量与指数均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，RvD1组小鼠颌下腺质量与指数均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.3 流式细胞术结果比较

与对照组比较，模型组小鼠血清Th1细胞比例显著升高，Th2细胞比例降低，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，RvD1组小鼠Th1细胞比例显著降低，Th2细胞比例升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图3。

2.4 血清细胞因子表达比较

与对照组相比，模型组小鼠血清IL-2和IFN-γ表达明显升高，IL-4和IL-10表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而与模型组相比，RvD1组小鼠血清IL-2和IFN-γ表达明显降低，IL-4和IL-10表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图4。

2.5 颌下腺组织mRNA表达比较

与对照组相比，模型组小鼠颌下腺组织T-betmRNA表达升高，而GATA-3mRNA表达降低，差异有统计学意义（P<0.05）；而与模型组相比，RvD1组小鼠颌下腺组织T-betmRNA表达降低，而GATA-3mRNA表达升高，差异有统计学意义（P<0.05），见图5。

3、讨论

SS是一类由于浆细胞或免疫细胞浸润，导致唾液腺、泪腺等外分泌腺体功能受损的自身免疫性疾病[9,10]。流行病学资料显示，我国SS人群的患病率为0.3%～0.7%，其发病率仅次于类风湿关节炎，在风湿免疫病中高居第2位[11]。目前，SS的病因和发病机制尚不完全明确。但一般认为SS是在病毒感染、遗传等病理因素引起机体免疫平衡的紊乱，导致唾液腺和泪腺出现炎症性改变[3,4]。因此，纠正免疫失衡是临床防治SS的重要环节。

RvD1是机体在促炎症消退过程中产生的内源性脂质分子，由5-脂氧合酶和15-脂氧合酶催化合成。RvD1与其受体结合后，通过纠正免疫失衡，降低促炎介质的合成与分泌，发挥调节免疫和促炎症消退作用[6,12]。研究表明，RvD1在自身免疫性疾病的发生、发展中起重要的作用[7,8]。朱曙光等证实，活动期溃疡性结肠炎患者血清RvD1含量显著高于缓解期患者和健康对照组，且RvD1含量与IL-6水平呈正相关[7]。Sun等的研究也表明，RvD1通过抑制结缔组织生长因子和炎症介质的表达，改善类风湿性关节炎引起的血管翳和软骨损伤[8]。本研究利用雌性NOD小鼠构建SS模型，结果提示模型组小鼠饮水量显著降低，而唾液量、颌下腺质量和指数均明显降低。而预处理RvD1可以降低SS小鼠饮水量，增加唾液分泌量、颌下腺质量和指数，表明RvD1对SS实验小鼠有治疗作用。

Th1细胞与Th2细胞之间存在着动态平衡，二者相互制约，共同维持机体内的免疫稳态。其中，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ等促炎细胞因子，而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-10抗炎细胞因子[13,14]。研究表明，Th1/Th2细胞失衡与SS的发病密切相关。其中，IL-2、INF-γ等促炎介质不仅可以促进Th1细胞的增殖同时还可以抑制Th2细胞表达，导致炎症反应加重[13,14]。动物研究也证实，降低Th1细胞表达，促进Th细胞向Th2方向分化，可以改善SS引起的炎症反应和组织损伤[5,17]。因此，调节Th1/Th2细胞平衡，抑制促炎介质的表达，能够达到治疗SS的目的。

既往研究表明，RvD1可促进Th细胞向Th2方向分化，改善慢性变异性眼病[18]。因此，本研究评估了RvD1对Th1/Th2细胞平衡的影响。结果表明，RvD1处理可显著降低Th1细胞比例，增加Th2型细胞比例。此外，RvD1处理可明显降低IL-2、IFN-γ等Th1型细胞因子的表达，上调IL-4和IL-10等Th2型细胞因子的表达。T-bet是Th1细胞特异性的转录因子，可以诱导IFN-γ的产生，而GATA-3是Th2细胞特异性的转录因子，可诱导Th细胞向Th2分化，也能抑制IFN-γ的表达[19]。本研究结果表明，RvD1能降低T-bet表达，提高GATA-3表达，从而促进Th1/Th2免疫平衡。上述结果表明，RvD1可能通过调节Th1/Th2细胞平衡而起到治疗SS的作用。

综上所述，本研究表明，RvD1可能通过调节Th1/Th2细胞平衡，改善SS引起的炎症和组织损伤。因此，本研究为RvD1治疗SS提供一定的理论依据。

参考文献:

[2]祁荆荆,张卓亚,伍树芳,等.干燥综合征小鼠中MDSCs数量及功能变化[J].免疫学杂志,2019,35(8):677-680.

[5]马武开,和秀丽,曾苹,等.润燥灵方对干燥综合征模型小鼠血清Th1/Th2的影响[J].中医杂志,2017,58(4):329-333.

[7朱曙光,李曙晖,高莉.血红素氧合酶-1､消退素D1及脂氧素A4在溃疡性结肠炎患者中的表达[J].中国医师杂志,2015,S2:34-37.

[8]侯佳奇,薛鸾.原发性干燥综合征发病机制概述[J].现代免疫学,2019,39(1):58-63.

[12]朱晓锋,胡宁.消退素D1在小鼠主动脉夹层中的作用及机制研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2019,21(9):967-970.

[13]谭静,林亚平,赵欢,等.艾灸对胃荷瘤大鼠瘤体内Th1､Th2类细胞因子表达的影响[J].免疫学杂志,2019,35(12):1061-1066.

[14]王瑞琼,郭超,王志旺,等.芒见赛保总菇对H_(22)肝癌细胞移植瘤小鼠Th1Th2漂移及Bax/Bcl-2表达的影响[J].免疫学杂志,2018,34(2)101-108.

[19]赛星月,李晓红,杜蓉.宫颈病变患者外周血中TH1TH2漂移状态与T-betiGATA-3的表达及意义[J].中国医药导报,2020,17(11)76-79.

文章来源：李树岗,贾超,宋远瑛.消退素D1对干燥综合征小鼠免疫调节的影响[J].免疫学杂志,2022,38(05):432-437.