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毛白杨雌、雄花蕾总黄酮含量及抗氧化活性的比较

2022-05-23 103 上传者：管理员

摘要：目的比较毛白杨雌、雄花蕾总黄酮含量及体外抗氧化活性。方法采集毛白杨雌株和雄株的花蕾作为样品。以儿茶素为对照，采用亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定总黄酮含量。以Trolox为阳性对照，采用DPPH和ABTS自由基清除法测定体外抗氧化活性。采用t检验对雌雄花蕾之间的差异进行比较。结果收集毛白杨雌株和雄株的花蕾各11株。雌、雄花蕾组总黄酮平均含量分别为25.60mg•g-1和30.39mg•g-1，DPPH法的雌、雄花蕾组的平均TEAC值分别为19.99mmol•L-1和23.91mmol•L-1，ABTS法的雌、雄花蕾组的平均TEAC值分别为19.97mmol•L-1和23.44mmol•L-1，差异均具有统计学意义（P<0.05）。结论毛白杨雄花蕾的总黄酮含量显著高于雌花蕾，雌、雄花蕾均具有良好的抗氧化活性，且以雄花蕾的活性显著。

关键词：
含量测定
总黄酮
抗氧化
毛白杨
雌雄异株植物
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毛白杨为杨柳科杨属落叶大乔木，在华北地区有大量的种植，属于常见的造林绿化树种，其叶、树皮和雄花序均可作为中药使用。1977年版《中国药典》中记载毛白杨干燥雄花序是中药杨树花的植物来源，具有化湿止痢的功效，用于治疗细菌性痢疾和急性肠炎[1]。在《中药大辞典》中记载，毛白杨树皮具有清热利湿的功效，主要用于治疗赤白痢疾、日久不止、淋浊白带、急性肝炎、支气管炎、肺炎、蛔虫、习惯性便秘等[2]。临床上使用毛白杨花、叶和树皮用于治疗急性菌痢、骨肉瘤、外伤感染[3,4]。杨树花目前还用作兽药，用于治疗牛羊猪等的痢疾、腹泻等疾病，并在山东等地有食用的历史[5,6,7]。毛白杨的化学成分主要有黄酮类、甾醇类、有机酸类、酚及其苷类[8,9,10]，具有抗炎镇痛、抗腹泻、抑菌、抗氧化等药理活性[11,12,13]。

雌雄异株植物是指在具有单性花的种子植物中，雌花和雄花长在不同的植株中[14]。对于雌雄异株植物性别之间存在的理化性质和药效活性的差异的研究，早期仅见极少的报道[15]。有研究通过高效液相色谱指纹图谱方法结合多元统计分析方法对毛白杨的树皮进行雌雄的比较发现，雌株中micranthoside的含量高于雄株，而siebolsideB、樱花苷、异樱花苷、isograndidentatinA的含量低于雄株[16]。有研究通过顶空进样固相微萃取气质联用法对毛白杨花蕾的挥发性成分进行比较发现，雌株中2-环己烯-1-酮、苯甲酸苄酯和苯甲酸甲酯的含量高于雄株，而苯甲酸乙酯的含量低于雄株[17]。通过磁共振技术结合多元统计分析对毛白杨雌雄花蕾进行化学成分研究发现，雌雄花蕾间主要差异成分有胡萝卜苷、β-谷甾醇、熊果酸和白桦脂酮酸，均为雄株中的含量高于雌株[18]。尽管存在一些成分含量高低不等的现象，但对于雌雄异株植物毛白杨的花蕾尚未见总黄酮含量及抗氧化活性差异的研究报道。

本文收集了成年毛白杨雌株和雄株的花蕾，通过亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定了总黄酮的含量，通过DPPH和ABTS自由基清除法评价了体外抗氧化活性，并进行了雌雄组之间的比较，为毛白杨的开发利用了提供科学依据。

1、材料

1.1 试药

于2020年2月23日至28日在北京市东城区东直门北大街、通教寺、民安小区、安定门东大街、青龙胡同和朝阳区黄金苑等地点(东经116°22'53''～116°26'57''，北纬39°52'36''～39°57'17'')采集了成年毛白杨的花蕾，阴干。性别是通过该植株之后形成的花序和果实确认。雌株花蕾标记为F1～F11，雄株花蕾标记为M1～M11。经中国中医科学院中药研究所巢志茂研究员鉴定为杨柳科植物毛白杨的干燥花蕾，样品贮藏于中国中医科学院中药研究所。

亚硝酸钠、氢氧化钠(分析纯，北京化工厂)，硝酸铝[分析纯，福晨(天津)化学试剂有限公司]，儿茶素对照品(批号：154-23-4，纯度：98%，成都埃法生物科技有限公司)，6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸[Trolox，货号：238813，Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司，纯度≥97%]，2，2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH，批号：D1915107，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，纯度≥97%)，2，2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐[ABTS，货号：A1888，纯度≥98%，Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司]；无水乙醇(分析纯，天津市鼎盛鑫化工有限公司)，甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

1.2 仪器

TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；OhausCP224C型电子天平[精度：0.1mg，奥豪斯(上海)仪器有限公司]；ME155DU型电子天平[精度：0.01mg，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DFT-50A型手提式高速粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；DFD-700型双列四孔电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)。

2、方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备

将样品粉碎，过40目筛。精密称取2.0g粉末，置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，称定质量后，水浴锅上加热回流30min，放置室温后，再次称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.1.2 显色溶液的制备

精密称取亚硝酸钠5.0g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀即得5%NaNO2溶液。精密称取硝酸铝10.0g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀即得10%Al(NO3)3溶液。精密称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀即得1mol·L-1NaOH溶液。精密称取DPPH7.00mg，加甲醇溶解并定容至100mL棕色量瓶中，摇匀即得0.07mg·mL-1DPPH溶液。精密称取ABTS0.10g，加水溶解并定容至25mL棕色量瓶中，摇匀即得7mmol·L-1ABTS溶液。精密称取过硫酸钾0.19g，加水溶解并定容至5mL棕色量瓶中，摇匀即得140mmol·L-1K2S2O8溶液。

2.2 总黄酮的含量测定

参考相关文献[19,20]并对测定方法进行优化。

2.2.1 标准曲线的制备

精密称取儿茶素10.80mg，加水溶解并定容至100mL量瓶中，摇匀，即得0.11mg·mL-1儿茶素对照品溶液。精密吸取0.11mg·mL-1儿茶素对照品溶液1.4、1.6、2.0、3.0、4.0、5.0mL，置于25mL量瓶中，加入6mL水，摇匀，加入5%NaNO21mL，摇匀，静置6min，加入10%Al(NO3)31mL，摇匀，静置6min，加入1mol·L-1NaOH溶液10mL，加水至刻度线，摇匀，放置10min后测定，以70%甲醇为空白，在510nm的波长处测定吸光度，以儿茶素对照品溶液质量浓度(mg·mL-1)为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2.2 供试品溶液的测定

精密吸取毛白杨雌、雄花蕾的供试品溶液20μL，按“2.2.1”项下方法测定吸光度。根据标准曲线计算毛白杨雌、雄花蕾中总黄酮的含量。

2.3 DPPH自由基清除能力测定

参考相关文献[21,22]并对测定方法进行优化。

2.3.1 标准曲线的制备

精密称取Trolox对照品10.14mg，加甲醇溶解并定容至50mL棕色量瓶中，摇匀，即得0.20mg·mL-1Trolox对照品溶液。精密吸取Trolox对照品溶液20、40、60、80、100、120μL，置于5mL棕色量瓶中，加入0.07mg·mL-1DPPH溶液2mL，摇匀，加甲醇至刻度线，摇匀，避光静置30min，在517nm波长下测定吸光度为A0，计算DPPH自由基清除率，以Trolox对照品溶液的浓度(μmol·L-1)为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线。

DPPH清除率(%)=[1-(A1-A0)/A2]×100%

式中：A1为70%甲醇空白组的吸光度；A2为DPPH溶液对照组的吸光度。

2.3.2 供试品溶液的测定

将“2.1.1”项下供试品溶液稀释10倍，精密吸取20μL，按“2.3.1”项下方法测定吸光度A0，平行测定3次，取平均值，计算DPPH自由基清除率。根据标准曲线结合稀释程度计算TEAC值。TEAC值是指在对DPPH自由基相同的清除率情况下，样品所对应的Trolox浓度。

2.4 ABTS自由基清除能力测定

参考相关文献[23,24]并对测定方法进行优化。精密吸取140mmol·L-1K2S2O8溶液176μL置于具塞锥形瓶中，加入7mmol·L-1ABTS溶液10mL，摇匀，室温且黑暗条件下反应16h，即得ABTS储备液。使用前量取一定量的ABTS储备液，加无水乙醇稀释，在734nm波长下测定吸光度，直至稀释后的吸光度为(0.70±0.02)，即得ABTS工作液。

2.4.1 标准曲线的制备

分别精密称取Trolox对照品0.24、1.02、1.50、2.14、2.60、3.16mg置于5mL棕色量瓶中，加无水乙醇溶解并定容，摇匀，即得0.048、0.204、0.300、0.428、0.520、0.632mg·mL-1Trolox对照品溶液。精密吸取各质量浓度的Trolox对照品溶液20μL，置于5mL棕色量瓶中，加入ABTS工作液3mL，摇匀，避光反应4min，在734nm的波长下测定吸光度为Aa，计算ABTS自由基清除率，以Trolox对照品溶液的浓度(mmol·L-1)为横坐标，清除率为纵坐标，绘制标准曲线。

ABTS清除率(%)=[1-(Ab-Aa)/Ac]×100%

式中：Ab为70%甲醇空白组的吸光度；Ac为ABTS工作液对照组的吸光度。

2.4.2 供试品溶液的测定

将“2.1.1”项下供试品溶液稀释10倍，精密吸取20μL，按“2.4.1”项下方法测定吸光度Aa，平行测定3次，取平均值，计算ABTS自由基清除率。根据标准曲线结合稀释程度计算TEAC值。TEAC值是指在对ABTS自由基相同的清除率情况下，样品所对应的Trolox浓度。

3、结果

3.1 总黄酮含量测定结果

按“2.2.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=31.50X-0.01(r2=0.9995)，线性范围为0.0069～0.0259mg·mL-1。按“2.2.2”项下方法对22个毛白杨花蕾样品进行总黄酮含量的测定，结果见表1。

3.2 DPPH自由基清除法

按“2.3.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=1.187×104X+2.53(r2=0.9990)，线性范围为0.0081～0.0049mg·mL-1。按“2.3.2”项下方法对22个毛白杨花蕾样品的DPPH自由基清除能力进行测定，其TEAC值结果见表2。

3.3 ABTS自由基清除法

按“2.4.1”项下方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=105.25X+1.22(r2=0.9998)，线性范围为0.0480～0.6320mg·mL-1。按“2.4.2”项下方法对22个毛白杨花蕾样品的ABTS自由基清除能力进行测定，TEAC值结果见表2。

3.4 总黄酮含量的统计学分析

运用IBMSPSSStatistics25对毛白杨花蕾的总黄酮含量进行统计学分析，结果呈明显的正态分布(P>0.05)；对其进行独立样本t检验，结果显示雌雄花蕾之间的总黄酮含量差异具有统计学意义(P<0.05)。其中雌花蕾的总黄酮含量为24.30～27.56mg·g-1，雄花蕾的总黄酮含量为25.54～32.55mg·g-1。雌雄花蕾之间的结果比较显示，雄花蕾中的总黄酮含量高于雌花蕾，说明毛白杨的总黄酮含量与性别有关。

3.5 体外抗氧化活性的统计学分析

运用IBMSPSSStatistics25分别对毛白杨雌雄花蕾的TEAC值(DPPH法和ABTS法)进行统计学分析，结果认为均呈明显的正态分布(P>0.05)；对DPPH法和ABTS法各自的TEAC值分别进行独立样本t检验，结果显示这两种方法的TEAC值在雌雄花蕾之间差异均具有统计学意义(P<0.05)。其中DPPH法毛白杨雌、雄花蕾的TEAC值分别为15.62～24.22mmol·L-1和20.13～29.03mmol·L-1；ABTS法毛白杨雌、雄花蕾的TEAC值分别为19.08～21.61mmol·L-1和20.90～26.34mmol·L-1。雌雄差异之间的结果比较显示，雄花蕾的TEAC值(DPPH法和ABTS法)均大于雌花蕾。TEAC值越大，对DPPH和ABTS自由基的清除能力越强，抗氧化能力越强，即雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。

3.6 毛白杨花蕾总黄酮含量与其抗氧化活性的相关性分析

运用IBMSPSSStatistics25软件，将22个毛白杨花蕾的总黄酮含量与其对应的DPPH法和ABTS法所测定的TEAC值分别进行相关性分析，结果见表3。两种活性方法测定的TEAC值均与总黄酮含量成正相关，说明毛白杨花蕾的抗氧化活性与其总黄酮含量成正相关。

4、讨论

本研究通过亚硝酸钠-硝酸铝显色法测定了毛白杨雌雄花蕾的总黄酮含量，结果显示雌花蕾的总黄酮平均含量为25.60mg·g-1，雄花蕾的为30.39mg·g-1，两者差异有统计学意义，雄花蕾的黄酮含量高于雌花蕾。黄酮类成分多具有抗氧化、抗菌、抗炎等活性[25]，这可能是选择雄花序入药的理由之一。此外，通过DPPH和ABTS自由基清除法评价和比较毛白杨雌雄花蕾的体外抗氧化活性，认为雌雄花蕾均具有一定的抗氧化活性，雌花蕾的平均TEAC值(DPPH法和ABTS法)分别为19.99mmol·L-1和19.97mmol·L-1，雄花蕾的平均TEAC值(DPPH法和ABTS法)分别为23.91mmol·L-1和23.44mmol·L-1，雌雄花蕾的比较差异均具有统计学意义，雄花蕾两种方法的TEAC值均高于雌花蕾，表明雄花蕾的抗氧化活性高于雌花蕾。两种方法测得的毛白杨花蕾的体外抗氧化活性均与其总黄酮含量成正相关，表明黄酮类成分可能是杨树花的重要有效成分。

与毛白杨一样来源于雌雄异株植物的中药还有杜仲、天花粉、桑叶等，毛白杨的花蕾入药是有明确的性别限制，但是，其他品种在实际的中医临床应用中并未进行性别的区别和限制。毛白杨花蕾的抗氧化活性与雌雄有关，其他品种的中药是否也存在性别间活性大小的差异，临床上是否需要进行性别的区分，本研究的结果给出了一个新的启发。雌雄异株植物在外观性状上是存在一定差异的，开展化学成分含量、药效活性以及临床效果的差异的研究，不仅将揭示雌雄异株植物的性别本质，还将有可能在提高中医药的临床疗效提供新的思考角度。

参考文献:

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