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基于网络药理学探讨黄连防治2型糖尿病的作用机制

2022-06-29 148 上传者：管理员

摘要：目的：运用网络药理学分析黄连防治2型糖尿病的作用机制。方法：通过TCMSP及UniProt数据库查询黄连主要活性成分与相关作用靶点，在GeneCards、OMIM数据库中检索2型糖尿病靶点，并通过OmicShare软件获得黄连与2型糖尿病共同靶点，运用String数据库对共同靶点进行蛋白质相互作用（PPI）分析，构建黄连防治2型糖尿病靶点蛋白互作（PPI）网络，利用CytoScape软件构建黄连-化合物-靶点-2型糖尿病网络图，并通过R语言软件对其防治2型糖尿病作用靶点的基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路进行富集分析。结果：获得黄连成分中具有类药性、口服吸收良好的化合物10种，其防治2型糖尿病的潜在作用靶点94个，包括丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、白细胞介素6（IL-6）、丝裂原活化蛋白激酶（CASP3）、表皮生长因子（EGF）、转录因子AP-1（JUN）等，信号通路主要有缺氧诱导因子-1（HIF-1）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K/AKT）等。结论：黄连可通过多组分、多靶点、多机制防治2型糖尿病，为深入研究黄连防治2型糖尿病的潜在作用机制提供理论基础。

关键词：
2型糖尿病
中药复方
作用机制
网络药理学
黄连
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糖尿病是由遗传及环境因素相互作用而导致代谢紊乱的一类常见内分泌疾病，其中2型糖尿病约占90%[1]。且随着人们生活方式的改变，2型糖尿病的发病率也从老年人逐渐趋向于年轻人。西医认为糖尿病主要在于胰岛素的分泌不足、胰岛素抵抗以及糖脂代谢紊乱，从而造成血管病变，引起一系列并发症。中医学将糖尿病归属于“消渴”范畴，其病机为阴虚燥热，多以气阴两虚为主[2]。随着临床及基础研究的深入，中医药对糖尿病的改善作用逐渐受到关注。黄连(coptidisrhizoma)为治疗糖尿病的常用中药，包含黄连的中药复方在糖尿病防治中具有较好的临床疗效，如大黄黄连泻心汤[3]、黄连温胆汤[4]、三黄汤[5]、交泰丸[6]等，但对于黄连防治2型糖尿病的作用机制尚未从网络药理学层面进行过系统阐明。网络药理学是结合中药药理学、生物化学、结构生物学、基因组学与生物信息学等的新兴领域[7],突出了多组分、多靶点、多机制的作用特点。本研究基于网络药理学，初步分析黄连防治2型糖尿病的潜在作用机制，为黄连的应用及药物的开发提供参考依据。

1、资料与方法

1.1 活性成分及靶点的筛选

基于中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php),以“黄连”为关键词，设置口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18作为限定条件，从中获取符合条件的活性成分，进而得到相应的靶蛋白，通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)获得靶蛋白名称的人源靶点基因。

1.2 疾病候选靶点的筛选

GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)是以基因、转录组、蛋白质组、遗传等信息为主的综合数据库，将“T2DM”“Type2diabetes”“Diabetesmellitustype2”等关键词输入其中，得到2型糖尿病的相关基因，以相关性分值(Relevancescore)>30为筛选条件，获得符合条件的基因作为疾病候选靶点。

1.3 蛋白互作网络的构建

将黄连活性成分靶点与2型糖尿病的基因靶点通过R语言软件“venny.R”包得出二者交集的基因，即潜在靶点，利用CytoScape软件建立黄连-化合物-靶点-疾病网络图。将潜在靶点基因导入String数据库，以物种为人作为限定词，设置可信度为0.7,获取蛋白相互作用的关系，并下载TSV格式的文件，通过CytoScape及R语言“count.R”包得出蛋白互作(PPI)网络图与前30个核心靶点。

1.4 GO功能及KEGG通路富集分析

通过基因本体(GO)功能富集分析细胞组分(CC)、分子功能(MF)、生物过程(BP),并基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路的富集分析进一步了解黄连治疗2型糖尿病的核心靶点的作用机制。

2、结果

2.1 活性成分的获取

根据TCMSP数据库以OB≥30%,DL≥0.18为限定条件，得到相应化合物的候选靶基因158个，并通过R语言软件“venny.R”包处理获得黄连与2型糖尿病共有靶点，得到黄连有效成分10种，如Berberine、Berberrubine、Epiberberine等。

2.2 作用靶点网络的构建

基于GeneCards数据库检索与2型糖尿病的相关基因11533个，以Relevancescore>30为限定条件，经筛选最终得到871个靶点基因作为2型糖尿病的候选基因，并将其与黄连候选基因相互映射得到潜在靶点94个。将得到的黄连化合物活性成分及潜在治疗靶点导入CytoScape软件中，并设置网络边、节点等属性，得到黄连-化合物-靶点-2型糖尿病网络。通过网络分析显示该网络包含106个节点，256条边，其中蓝色图形代表潜在靶点，黄色图形代表活性成分，红色图形代表黄连，绿色图形代表糖尿病，可见黄连防治2型糖尿病具有多组分、多靶点的作用特点。(见图1)

2.3 PPI网络的构建及核心靶点的提取

将潜在靶点导入String数据库与CytoScape软件构建PPI网络(见图2),通过R语言“count.R”包分析得出前30个潜在核心靶点(见图3)。核心靶点有丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶1(AKT1)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、白细胞介素6(IL-6)、丝裂原活化蛋白激酶(CASP3)、表皮生长因子(EGF)、转录因子AP-1(JUN)等。

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析

GO功能富集分析得到110个生物过程，颜色越红表示富集到该条目的显著性越高。结果表明，黄连防治2型糖尿病主要通过调节细胞因子受体(cytokinereceptorbinding)、泛素样蛋白连接酶(ubiquitin-likeproteinligasebinding)、肽链内切酶活性(endopeptidaseactivity)、受体调节活性(receptorregulatoractivity)、蛋白质异二聚体活性(proteinheterodimerizationactiviy)等发挥作用。(见图4)

进一步将核心靶点进行KEGG通路富集分析，取排前20位的主要信号通路。RichFactor指差异表达的基因中位于该通路条目的基因数目与所有基因中位于该通路条目的基因总数的比值，RichFactor越大表示富集的程度越高；气泡大小表示基因的数量多少，气泡越大，富集到该通路基因数量越多；气泡颜色的深浅表示显著性的高低，颜色越红表示富集到该通路的显著性越高。结果显示黄连主要通过调控脂酰肌酸3激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)、缺氧诱导因子-1(HIF-1)、丝裂原活性蛋白激酶(MAPK)等信号通路改善2型糖尿病。(见图5)

3、讨论

本文基于网络药理学探讨黄连防治2型糖尿病的作用机制，结果显示黄连防治2型糖尿病的潜在活性成分有10种，潜在靶点94个，表明黄连防治2型糖尿病是通过多组分、多靶点共同作用的结果。通过对潜在靶点进行PPI数目及拓扑分析，可知黄连防治2型糖尿病的主要活性成分有Berberine、Berberrubine、Epiberberine等，主要靶点为AKT1、VEGFA、IL-6、CASP3、EGF、JUN等。研究表明，黄连成分Quercetin、Palmatine、Berberine等具有调节糖脂代谢、降低促炎因子、抗氧化、上调葡萄糖转运蛋白4的表达及升高胰岛素的水平作用，进而促进细胞对葡萄糖的摄取，达到降低血糖的目的[8,9,10]。其中炎症及免疫系统的激活在2型糖尿病发病过程中起到重要作用，参与胰岛素分泌及胰岛素抵抗[11,12]。因此促炎因子的降低，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6及白细胞介素-1β(IL-1β)等，可以减轻2型糖尿病及其并发症的发展。

通过对黄连治疗2型糖尿病核心靶点GO功能及KEGG通路富集分析可知，黄连主要通过调控HIF-1、MAPK、PI3K-Akt等信号通路，通过细胞因子受体、泛素样蛋白连接酶、肽链内切酶活性、受体调节活性、蛋白质异二聚体活性等发挥治疗作用。糖尿病是以胰岛素分泌不足或胰岛素抵抗致使血糖升高为特点的一种代谢紊乱性疾病，进而造成组织水肿、缺血及缺氧，可导致血管与神经等病变[13],HIF-1与细胞内缺氧反应密切相关，HIF-1信号通路的激活可提高VEGF的表达，VEGF具有调节血管生成及通透性的作用，可降低毛细血管密度，引起血管内皮细胞肿胀，基底膜增厚，也可抑制白细胞介素10(IL-10)的分泌，增强炎症反应[14,15]。此外，IL-6水平的升高参与炎症的发展，促进胰岛素抵抗[16]。胰岛素抵抗可抑制PI3K/AKT通路的激活[17],而PI3K/AKT信号通路在细胞的脂质代谢、葡萄糖稳态、细胞增殖及胰岛素调控血糖中具有重要作用。磷酸肌醇依赖蛋白激酶1(PDK1)促使激酶区域内的AKT1磷酸化，激活PI3K/AKT信号通路，从而促进葡萄糖转运蛋白4的膜转位，减轻胰岛素抵抗[18];MAPK信号通路的激活可能抑制胰岛素受体底物的磷酸化，导致胰岛素抵抗，也可下调葡萄糖转运蛋白4的表达，致使葡萄糖转运减少，引起血糖升高[19]。研究表明黄连及化合物quercetin可抑制MAPK信号通路的活化[20],刺激葡萄糖转运蛋白4的表达，从而起到降低血糖的作用。

本研究基于网络药理学对黄连防治2型糖尿病主要活性成分、潜在靶点及作用机制进行分析，表明黄连可通过多组分、多靶点、多机制协同作用改善2型糖尿病的发生发展。网络药理学作为一门新兴学科，其系统性、整体性的研究理念与中医药的多组分、多靶点、多机制的作用特点不谋而合[21],可为黄连防治2型糖尿病提供新的理论支持。

参考文献:

[2]史雅琼,马建伟.2型糖尿病患者中医证型分布及其并发症证型特点[J].河南中医,2017,37(10):1789-1791.

[3]郝建华,包毅敏,包芸,等.大黄黄连泻心汤对2型糖尿病大鼠骨骼肌中AMPKa､PGC-10､GLUT4表达的影响[J].中国医药导报,2019,16(33):13-18.

[4]陈亚昕,万红娇,朱金华,等.黄连温胆汤对2型糖尿病模型鼠空腹血糖､INS及肠道菌群变化的影响[J]中药药理与临床,2019,35(3)2-7.

[5]吴波,隋淼,朱艳,等.三黄汤治疗痰湿热结型2型糖尿病43例[J].河南中医,2019,39(6):839-842.

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[7]王永华,杨凌.基于系统药理学的现代中药研究体系[J].世界中医药,2013,8(7):801-808

[20]邱斌辉,李艳存,刘伟敬.基于网络药理学探讨黄芪治疗糖尿病肾病的作用机制[J].湖南中医杂志,2021,37(3):149-153.

文章来源：蔡然,宋轶.基于网络药理学探讨黄连防治2型糖尿病的作用机制[J].湖南中医杂志,2022,38(06):158-163.