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基于数据挖掘与德尔菲法的脾气虚证动物模型评价及用药特征分析

  2023-07-31    75  上传者:管理员

摘要:全面分析脾气虚证动物模型并明确模型评价指标,为该动物模型的规范化研究提供参考。方法 在中国知网数据库中检索脾气虚证动物模型相关实验性研究文献,分别对动物品系、造模方法、取材部位、评价指标和用药特征进行数据提取及分析。以此为基础聚焦高频评价指标进行德尔菲专家问卷调查,通过均数和变异系数等明确高效能的脾气虚证动物模型评价指标。同时,基于用药特征分析结果,通过以方测证进一步探讨脾气虚证动物模型的客观性和科学性。结果 共纳入146篇文献,动物模型以SD大鼠和雄性占比最高,取材部位依次为小肠、胃和脾脏,饮食失宜和游泳力竭双因素复合法是最常用的造模方法。德尔菲专家问卷调查表明,高效能的脾气虚证动物模型评价指标主要包括表观指标(大便溏泄、神疲乏力、皮毛枯槁无华等)、生化指标[胃动素、线粒体三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平、D-木糖吸收率等]和其他指标(食量减少、体质量下降、抓力下降等)。其中75篇文献报道了有效的治疗方药,最常用的方剂为四君子汤,高频药物为白术、甘草、茯苓、黄芪、党参和人参等,用药特征以性温、味甘、归脾经为主。结论 脾气虚证动物模型的构建主要为SD大鼠,多采用饮食失宜与游泳力竭的双因素复合法。综合表观指标、生化指标和其他指标的系统性模型评价方法具有科学性和合理性,将为脾气虚证动物模型的规范化提供参考。

  • 关键词:
  • 动物模型
  • 德尔菲法
  • 用药特征
  • 脾气虚证
  • 评价指标
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证候是证所表现的具有内在联系的症状和体征,是中医辨证的结果和论证的依据[1]。证候的规范化是中医学走向现代化、规范化的基石,而构建完善的中医证候动物模型是证候规范化研究的基本方法。脾气虚证是中医基础证候类型之一,以倦怠乏力、大便溏稀、食欲减退为主要表现[2],是临床多种疾病的常见证型[3,4,5]。目前,关于脾气虚证动物模型的研究主要涉及模型制备与评价方法等方面,但仍存在一些问题,如造模方法复杂多样,评价指标差异大、种类多,脾气虚、脾虚及气虚模型的研究常相互混杂,没有形成系统性的整合,这些问题导致了脾气虚证实验研究无法标准化和规范化,也阻碍了中医证候科学研究进程。

本研究通过数据挖掘对脾气虚证动物模型的构建方法和评价指标进行全面整理,结合德尔菲法[6]对评价指标进行专家意见征询,构建较为系统的脾气虚证动物模型评价方法。同时,通过以方测证探讨脾气虚证动物模型成功构建的客观性和科学性。以期为脾气虚动物模型的建立与评价提供科学依据,为中医证候动物模型的规范化研究提供参考。


1、资料与方法


1.1数据来源与处理

1.1.1文献检索与筛选

(1)检索策略:以“脾气虚”“动物模型”等为主题词在中国知网进行检索,时间为2010年1月1日—2022年10月1日。

(2)动物模型文献筛选:纳入标准是1)脾气虚证动物模型造模成功的实验研究性文献;2)同一作者进行拆分数据发表的文献最终仅计入1次;3)同一篇文献中同一指标采用不同方法进行检测最终仅计入1次。排除标准是1)会议论文、理论性研究、综述及资料不全的文献;2)脾虚证、脾阳虚证及气虚证等非脾气虚证或指代性不明的文献;3)重复发表的文献。

(3)用药特征文献筛选:纳入标准是1)中药治疗有效改善模型动物脾气虚证的文献;2)处方信息完整的文献。排除标准是1)仅有方名无药物组成的文献;2)处方药物记载不全的文献;3)无治疗措施或非中药治疗手段的文献。

由2名评价者根据纳入、排除标准独立进行筛选,阅读全文,剔除不合格文献。如出现分歧,由第3名评价者判定,直至意见一致。

1.1.2数据录入

以实验动物品系、性别、取材部位、造模成功时间、评价指标、处方名、具体用药及药物性、味、归经为分类依据,提取数据并录入Excel表,建立脾气虚证动物模型数据集。

1.1.3术语规范化

参照《中医实验动物模型方法学》[7]及《实用中医证候动物模型学》[8]规范模型要素数据,如“大便溏泄、便溏、泄泻”归为“大便溏泄”。参照《中国药典》2020年版一部[9]及《中药学》[10]规范中药名及性、味、归经,如将“生黄芪、炙黄芪、黄芪”归为“黄芪”,将“微甜”“微甘”归为“甘”等。

1.2德尔菲专家问卷调查

1.2.1调查问卷

选取文献研究中高频评价指标(频次≥5)构建条目池,制定《脾气虚证动物模型评价指标专家意见征询问卷》[6],邀请专家根据重要性进行评价。

1.2.2评价指标及量化

通过对评价指标进行归纳,将其分为定性指标和定量指标。定性指标为表观指标,主要是对动物的外观、行为状态以及排泄物性状等由主观观察得出的定性结果。定量指标分为生化指标和其他指标,强调通过客观化、多维度视角对动物的功能状态进行评估。生化指标是从分子水平检验动物的功能状态,其他指标从动物的体质量、食量及运动量等方面进行评估。评价指标的重要性采用Likert的五尺度评分法[11],根据“很不重要、不重要、一般、重要及很重要”分别赋1、2、3、4、5分。

1.3统计分析

Excel 2021软件用于统计模型要素及用药特征条目的频次与频率。SPSS 25.0用于统计专家问卷指标,包括:1)专家积极系数,用回收率表示(回收率=回收份数/总份数);2)专家意见集中程度,以平均数、满分率(K,满分频数/总频数)、等级和(S,专家对某项指标赋值后的总得分)表示,这些指标越高,表明专家的意见越集中;3)专家意见的协调程度,以变异系数(CV,标准差/均值)和肯德尔和谐系数(W)表示,CV越小,提示专家对该指标重要性评价的一致性越高[12];W是专家对所有指标评价的协调程度,其值在0~1,P<0.05认为有统计学意义,W值越大,协调程度越高,德尔菲法的W值多在0.5上下波动[13]。将满足以下条件的指标纳入脾气虚证动物模型的评价标准:1)均数≥3.5;2)等级和≥70;3)CV≤0.3。


2、结果


2.1文献筛选

共检索出442篇文献,包括学术期刊279篇、学位论文145篇、会议论文18篇。根据纳排标准筛选后,纳入146篇文献。其中,有75篇文献中报道了具有改善脾气虚证较好的方药,涉及到67个方剂和48味中药。

2.2动物模型、造模方法、取材及评价指标

2.2.1动物模型

在脾气虚证动物模型中,使用频次最高的动物品系依次为SD大鼠(105篇,71.92%)、Wistar大鼠(25篇,17.12%)、C57BL/6小鼠(8篇,5.48%)。性别以雄性最多(81篇,55.50%),其次为雌雄各半(54篇,37.00%),见表1。

表1实验动物品系、性别频次分布  

2.2.2造模方法

有饮食失宜法、游泳力竭法、耗气破气法、苦寒泻下法、情志所伤法、睡眠剥夺法、跑步疲劳法和利血平皮下注射法共8种造模方法。这些造模方法经过组合后,使用频次排序为双因素复合法102篇、3因素复合法31篇、单因素法24篇。其中饮食失宜、游泳力竭的双因素复合法(78篇,49.68%)频次最高。造模时间分布情况中,频次最高的为造模14~16 d的饮食失宜和游泳力竭复合法,见表2。

2.2.3取材部位

小肠频次最多(37篇,25.70%),其次为胃(27篇,18.80%)和脾脏(23篇,16.00%),见表3。

2.2.4评价指标

经统计高频指标共有64个,其中表观指标16个、生化指标37个、其他指标11个,各类型指标排序前8的指标分布情况见图1。由于评价指标较多,导致模型评价存在一定的困难,因此,本研究进行了德尔菲专家问卷调查以明确动物模型的高效评价指标。

2.3专家问卷

本次调查共2轮,共邀请40名中医专家参与问卷调查。涉及华东(上海市、浙江省、江苏省、福建省、江西省)、华北(北京市、天津市、河北省、山西省)、华中(湖北省、湖南省)、东北(辽宁省)、华南(广东省)、西南(四川省)、西北(青海省、宁夏回族自治区)共16个省市,地域分布范围广,地域影响小。所有专家均具有高级职称,且90%的专家学历为研究生及以上。2轮问卷全部回收,专家积极系数为100%。问卷中,各指标的均数、满分率、等级和及CV见表4。

第1轮问卷表观指标、生化指标、其他指标的W值分别为0.257、0.159和0.247,c2为41.149、54.212和44.397。第2轮问卷W值分别为0.533、0.345和0.259,c2为85.23、117.246和46.668,见表5。2轮专家W值均有统计学意义,第2轮专家W值较第1轮有较大提高,表明专家对脾气虚证动物模型评价指标判定条目的认同度明显提高。根据专家问卷结果,最终确定脾气虚证动物模型评价指标见表6。

表2造模方法分布

表3取材部位分布  

2.4方药分析

经统计,高频有效方剂中四君子汤(26次,39%)使用最多,其次为白术茯苓汤(7次,10%)、补中益气汤(5次,7%)及香砂六君子汤(5次,7%),其余为自拟方。频次>5的药物共17味,依次为白术、甘草、茯苓、黄芪、党参、人参等,见表7。

药物性味归经分析发现,温性药物占比最高(23次,47.92%),其次为平性(13次,27.08%)、寒性(10次,20.83%)。药味中,甘味药占比最多(31次,41.33%),其次为苦性(20次,26.67%)、辛性(18次,24.00%)。归经中,药物归脾经最多(34次,25.37%),其次为肺经(25次,18.66%)、胃经(21次,15.67%),归经频次前6位见图2。


3、讨论


中医证候的规范化研究是中医基础理论研究的重要内容,是揭示中医证的本质研究的重要途径。基于文献的数据挖掘可为证候研究提供数据来源,德尔菲专家问卷调查可提高证候标准的科学性与指导性,将数据挖掘和德尔菲法相结合,能够对脾气虚证动物模型做出全面、科学的评价,促进中医证候的规范化研究。

图1高频指标分布   

表4评价指标问卷调查结果  

表5专家意见协调系数

表6脾气虚证动物模型评价指标

前期文献调研发现,脾气虚证动物模型在2010年之前研究力度和学术关注度较低,在近10年出现阶梯式增长,得到广泛关注,故本研究基于近10年的文献资料进行展开。本研究显示,在模型动物选择上,SD大鼠是主要的模型动物。SD大鼠具有皮毛、尾巴和耳朵等部位颜色淡的特点,便于收集脾气虚证的四诊指标。目前,脾气虚证造模方法较多且以中医病因造模法为主。中医病因造模法是基于中医学病因学说与发病理论,模拟导致“证”形成的致病因素并作用于实验动物,使模型呈现特定的证候特征的造模方法[14]。本研究发现,饮食失宜和游泳力竭复合法最为多见。饮食失宜主要包括饥饱失常和饮食偏嗜。饮食物主要是依赖脾胃的纳运作用进行消化吸收,过饥、过饱均会损伤脾胃。饮食偏嗜是遵循《素问·生气通天论》中“味过于酸,肝气以津,脾气乃绝”“味过于苦,脾气不濡,胃气乃厚”的理论。游泳力竭法是使模型动物负重后游泳,直至劳倦。《脾胃论·脾胃胜衰论》:“形体劳役则脾病”,劳倦过度会耗伤大量气血。脾为气血生化之源,脾气健旺则气血生化有源,而劳倦过度易损耗脾气导致脾气亏虚。杨关林等[15]采用饮食失宜和游泳力竭法,损伤大鼠脾胃,造成脾气虚证。此外,苦寒泻下、耗气破气也是脾气虚证动物模型常用的方法。《本草经疏·五脏六腑虚实门》:“脾虚,忌下、降泄、破气、苦寒。”苦寒泻下、耗气破气法可导致脾气虚损。郑小伟等[16]采用苦寒泻下的大黄水煎剂进行灌胃,谢磊等[17]则在隔日喂食的基础上结合耗气破气的小承气汤进行灌胃,均造成了大鼠脾气虚症状。利血平皮下注射是利用利血平的胃肠道不良反应,使动物出现消痩、腹泻、纳呆等与脾气虚证类似的临床表现。梁雪丹等[18]通过利血平皮下注射导致大鼠出现毛色无泽、便溏,体质量、食水量下降等症状,成功建立脾气虚动物模型。此外,情志刺激、睡眠剥夺及跑步疲劳也与脾气虚证密切相关。在脾气虚型亚健康状态中,研究人员在饮食失宜与游泳力竭的基础上结合情志所伤法,造成脾气虚模型[19],睡眠剥夺与饮食失宜及跑步疲劳结合也可造成模型动物脾气虚[20]。

表7药物使用频次分布  

图2药性、药味、归经分布图   

在取材部位上本研究发现脾气虚证动物模型研究的焦点或所关联的疾病与“小肠、胃、脾脏、胸腺、海马、心脏、骨骼肌”等相关,这与中医“脾”的生理功能和特性息息相关。脾主运化,脾气亏虚则运化水谷的功能障碍,可见腹胀、便溏之症。现代医学认为肠道中的胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、血管活性肠肽等脑肠肽具有调节胃肠道运动的作用[21],其表达情况可以反映脾主运化的功能。脾主升,胃主降,脾气亏虚升而不及,则胃通降失常,研究观察到脾虚组大鼠的胃排空率低于对照组[22]。脾脏和胸腺是重要的免疫器官,因此脾脏指数和胸腺指数常用来评价动物的免疫功能[23]。脾藏意、主思,海马是学习记忆的关键部位,脾气虚大鼠可见记忆功能下降、海马神经元数量减少[24]。脾为气血生化之源,血为水谷之精气,总统于心而生化于脾。若脾气亏虚,则生化乏源,气血衰少,脉道失盈,亦见统摄无权、行血异常,进而导致“脉道不利”,影响心主血脉的功能,最终导致心脏病变,故心脏在脾气虚证中也受到广泛关注。《灵枢·本神》:“脾气虚则四肢不用”,若脾虚运化失司,肌肉失养,则见肌肉萎缩、四肢无力。基于此,研究人员发现脾气虚大鼠可见肌力减退、肌肉萎缩、腓肠肌线粒体受损、肌细胞凋亡及炎症因子浸润[25]。

在脾气虚证动物模型中,表观体征一直是脾气虚证的常用评价指标,但研究人员对表观体征进行评价时往往存在一定的主观性,缺乏更加科学化的客观指标的支持。本研究使用德尔菲法科学评价脾气虚证评价指标,汇聚了众多专家的意见,以达成对动物的脾气虚证诊断共识。结果显示,表观指标的专家意见集中程度最高、协调性最好,表明表观指标可能是脾气虚证动物模型主要的评价手段。其中大便溏泄、神疲乏力、皮毛枯槁无华、蜷缩扎堆及形体消瘦等指标受到专家的高度认可,便溏、神疲乏力、体瘦是临床脾气虚患者的症状,而皮毛枯槁无华与蜷缩扎堆则是脾气虚证动物特有的表现[26]。食量减少、体质量下降、抓力下降等其他指标是脾气虚患者“食欲减退、肌瘦无力”的临床表现。生化指标分析发现,脾气虚不仅与消化吸收功能相关,还与现代医学线粒体能量代谢、免疫功能、神经内分泌、血液质量、氧化损伤、炎症反应等息息相关。基于“脾为后天之本”为机体提供生命活动所必须的能量,与线粒体通过三羧酸循环产生ATP为细胞提供能量存在相似性,认为线粒体能量代谢障碍与脾气虚密切相关[27],脾气虚动物会出现ATP水平下降[28]。《灵枢·五癃津液别》:“脾为之卫”,《脾胃论·脾胃盛衰论》:“内伤脾胃,百病由生”,《金匮要略·脏腑经络先后病脉证第一》:“四季脾旺不受邪”均指出了脾在防病驱邪方面的重要作用,这与现代医学的免疫功能内涵不谋而合。脾气虚与神经系统密切相关,脾通过“脑-肠轴”,将胃肠道与中枢神经系统联系起来,调节胃肠道运动以及内分泌平衡[29]。脾气虚与血液质量密切相关,《灵枢·决气》:“中焦受气取汁,变化而赤,是谓血”,中焦脾胃功能正常,则运化水谷精微上输心肺,奉心化赤为血,参与血液的生成。脾气虚与氧化损伤密切相关,脾气虚会导致体内自由基代谢的紊乱,导致抗氧化酶清除自由基的活性降低、脂质过氧化损伤增强,应用具有健脾益气功能的四君子汤治疗可以起到抗氧化的作用[30]。此外,研究发现脾气虚大鼠的手术伤口炎症反应失调,中性粒细胞散在分布,提示炎症反应与脾的功能也是密切相关的[31]。

“以方测证”是中医学认识病证的重要方法,其通过处方的药物构成与功效,并结合用药后的反应,可推测研究对象的所属证型[32],故选择正确的处方是验证模型准确性的关键。本研究对脾气虚证动物模型的有效方药进行分析发现,经典补气方剂“四君子汤”是目前使用最多的方剂。白术、甘草、茯苓、黄芪、党参等是有效的高频药物,其功效多以益气健脾为主,可以显著改善模型动物的脾气虚症状。药物药性以温、平为主,药味以甘、苦、辛为主,药物归经以脾经、肺经、胃经为主。甘味药能补益,苦味药能燥湿,辛味药能发散、行气,能发挥补脾、醒脾并防止湿困脾的作用。入脾、胃经药物可直达病变脏腑以调理脾胃功能,入肺经药物则可通过“母子关系”达到肺强脾健的效果。可见,方药分析结果与模型病机相吻合。

综上所述,中医的“脾”不仅仅与消化吸收有关,而是一个涵盖现代医学中消化系统、免疫系统、能量代谢系统、神经系统、造血系统、运动系统、氧化系统的多元系统单位。脾气虚证动物模型的构建主要动物为SD大鼠,多采用饮食失宜与游泳力竭的双因素复合法。模型的评价应更加科学、全面地反映消化吸收、运动及免疫功能的表观指标和其他指标,与其量化的胃肠激素、能量代谢、免疫、血液质量、氧化损伤及炎症因子等微观生化指标相结合。模型的辨证应当选择与其病机相符的方药,可选择药性温、平,药味以甘、苦、辛为主,归脾、胃、肺经的药物。本研究通过对脾气虚证动物模型的建立、评价及用药特征的全面分析,以提高脾气虚证实验研究的准确性、科学性,从而为中医证候的规范化研究提供参考。


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基金资助:国家自然科学基金面上项目(82174246); 浙江省卫生创新人才项目(浙卫办[2020]18号);


文章来源:张裕惠,薛丹,王憭瑶等.基于数据挖掘与德尔菲法的脾气虚证动物模型评价及用药特征分析[J].中草药,2023,54(14):4590-4598.

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