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漆黄素对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞活性的影响

2021-11-04 48 上传者：管理员

摘要：目的探讨漆黄素对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心肌成纤维细胞活性及白细胞介素33(IL-33)/白细胞介素1受体样分子1(ST2)信号通路的影响。方法体外培养人心肌成纤维细胞,并将细胞分为对照组、AngⅡ组、漆黄素1组(1.25μmol/L)、漆黄素2组(2.5μmol/L)、漆黄素3组(5.0μmol/L)。细胞计数试剂盒8法检测心肌成纤维细胞活力。免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。ELISA法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达。Westernblot法检测增殖蛋白β连环蛋白、细胞周期蛋白D1及α-SMA、IL33/ST2信号通路蛋白表达。结果与对照组比较,AngⅡ组心肌成纤维细胞活力、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、β连环蛋白、细胞周期蛋白D1、IL-33、ST2表达明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与AngⅡ组比较,漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞活力、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、β连环蛋白、细胞周期蛋白D1表达明显降低,且随着漆黄素浓度升高,心肌成纤维细胞各指标呈剂量依赖性降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与AngⅡ组比较,漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达明显降低(1.26±0.21、0.77±0.15、0.29±0.13vs1.75±0.19,1.15±0.14、0.64±0.12、0.28±0.09vs1.62±0.16,P<0.05),且随着漆黄素浓度升高,IL-33、ST2表达逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论漆黄素能够抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞活化及IL-33/ST2信号通路,可能是心肌纤维化治疗的潜在药物。

关键词：
受体
心内膜心肌纤维化症
白细胞介素1
白细胞介素33
细胞外基质
血管紧张素Ⅱ
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心肌纤维化是心力衰竭发展的重要机制，同时也是造成心力衰竭患者预后不良的主要原因[1]。心脏成纤维细胞过度活化导致细胞外基质过量积累是心肌纤维化的主要病理机制，因此抑制心肌成纤维细胞过度活化对治疗心肌纤维化至关重要[2]。白细胞介素(interleukin,IL)-33广泛表达于成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞等多种细胞类型中，IL-1受体样分子1(ST2)是IL-33的受体。研究表明，IL-33/ST2信号通路激活与缺血再灌注、免疫性疾病以及心、肝、肺等器官纤维化发生有关[3,4]。漆黄素是一种小分子黄酮类化合物，在多种疾病中表现出抗血管生成、抗氧化应激和抗炎的特性[5]。Liu等[6]研究表明，漆黄素治疗能够改善心肌梗死模型大鼠心功能，减轻大鼠心房炎症和纤维化。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)能够促进心肌成纤维细胞增殖和胶原合成增加，引起心肌纤维化[7]。因此，本研究通过体外培养人心肌成纤维细胞，并用AngⅡ进行刺激，分析不同浓度漆黄素对心肌成纤维细胞活性及IL-33/ST2信号通路的影响，探讨漆黄素在心肌纤维化过程中可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1 主要药品和试剂及仪器

漆黄素(原料药，纯度99%,购自成都瑞芬思生物科技有限公司，批号PHL82542);AngⅡ(购自美国SIGMA公司，批号A9847);胎牛血清、DMEM培养液、胰蛋白酶、青霉素-链霉素(美国Gibco公司，批号分别为10099、0030034DJ、25200056、15070063);Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原ELISA试剂盒(购自武汉云克隆科技股份有限公司，批号分别为SEA571Hu、SEA176Hu);β连环蛋白、细胞周期蛋白D1、IL-33、ST2、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体、羊抗兔IgGH&L二抗(英国abcam公司，批号分别为ab6302、ab16663、ab187060、ab228543、ab8245、ab124964、ab205718);蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、细胞计数试剂盒8(购自上海碧云天生物技术公司，批号分别为P0033、P0012、C0037);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,购自北京索莱宝科技有限公司，批号C0060)。酶标仪(购自上海胜卫电子科技有限公司，型号MB16-414);激光扫描共聚焦显微镜(购自日本Olympus公司，型号FV300);蛋白凝胶成像仪(购自美国ThermoFisher公司，型号E-gelimager)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人心肌成纤维细胞购自青旗(上海)生物技术发展有限公司，批号BFN608007119。常规复苏人心肌成纤维细胞，加至含10%胎牛血清、100U/ml青霉素-链霉素的DMEM培养液中，37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔1～2d更换新鲜培养液，细胞稳定生长至对数期时用于后续实验。

1.2.2 细胞处理及分组

收集处于对数期心肌成纤维细胞，调整浓度为5×105个/孔接种于6孔板中，细胞贴壁，加入无血清DMEM培养液饥饿细胞，100nmol/LAngⅡ诱导心肌成纤维细胞，将细胞分为对照组(仅添加新鲜培养液)、AngⅡ组、漆黄素1组(1.25μmol/L)、漆黄素2组(2.5μmol/L)、漆黄素3组(5.0μmol/L)[7,8]。

1.2.3 细胞计数试剂盒8法检测心肌成纤维细胞活力

收集各组对数期心肌成纤维细胞，调整浓度为5×104个/孔加于96孔板中，每组选取6个重复，设置空白组仅添加培养液，培养48h后加入10μl细胞计数试剂盒8试剂，37℃避光培养2h,弃上清，酶标仪450nm波长处检测每孔吸光度(A)值，计算细胞活力。

1.2.4 免疫荧光染色检测心肌成纤维细胞α-SMA

收集各组心肌成纤维细胞，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定15min,0.3%TritonX-100透化20min,1%牛血清白蛋白封闭，加入α-SMA单抗(1〯200),4℃过夜，加入羊抗兔免疫球蛋白GH&L二抗(1〯2000),37℃孵育30min,PBS洗涤3次，DAPI染色，激光扫描共聚焦显微镜获取分析图像。细胞核为蓝色，α-SMA阳性细胞的细胞质为绿色。

1.2.5 ELISA法检测Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达

收集各组心肌成纤维细胞培养上清液，ELISA试剂盒双抗体夹心法检测细胞中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达，实验操作严格按照说明书进行。

1.2.6 Westernblot法检测细胞增殖蛋白及IL33和ST2信号通路蛋白表达

收集各组对数期心肌成纤维细胞，蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定总蛋白浓度。每组设置3个重复，对蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束蛋白转至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭2h,分别加入一抗稀释液：α-SMA(1〯1000)、β连环蛋白(1〯1000)、细胞周期蛋白D1(1〯500)、IL-33(1〯1000)、ST2(1〯1000)、GAPDH(1〯1000),4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入羊抗兔免疫球蛋白GH&L二抗稀释液(1〯3000),室温孵育1h,TBST洗膜3次，蛋白凝胶成像仪分析蛋白表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS25.0统计软件，计量资料以x¯±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组心肌成纤维细胞活力比较

对照组、AngⅡ组、漆黄素1组、漆黄素2组和漆黄素3组心肌成纤维细胞活力分别为100%、(357.49±11.42)%、(258.26±9.54)%、(184.57±8.25)%和(138.43±8.17)%。与对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞活力明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组比较，漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞活力明显降低，且随着漆黄素浓度升高，心肌成纤维细胞活力呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 各组心肌成纤维细胞α-SMA表达比较

免疫荧光染色结果表明，AngⅡ处理后α-SMA蛋白表达升高，漆黄素处理后α-SMA蛋白表达逐渐降低(图1～5)。Westernblot结果表明，对照组、AngⅡ组、漆黄素1组、漆黄素2组和漆黄素3组α-SMA表达分别为0.09±0.07、0.85±0.11、0.59±0.09、0.37±0.08和0.15±0.06。与对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞α-SMA表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组比较，漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞α-SMA表达明显降低，且随着漆黄素浓度升高，心肌成纤维细胞α-SMA表达呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05,图6)。

2.3 各组心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达比较

与对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组比较，漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达明显降低，且随着漆黄素浓度升高，心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05,表1)。

2.4 各组心肌成纤维细胞增殖蛋白β连环蛋白和细胞周期蛋白D1比较

与对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞β连环蛋白、细胞周期蛋白D1表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组比较，漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞β连环蛋白、细胞周期蛋白D1表达明显降低，且随着漆黄素浓度升高，心肌成纤维细胞β连环蛋白、细胞周期蛋白D1表达呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05,表2,图7)。

2.5 各组心肌成纤维细胞IL-33和ST2比较

与对照组比较，AngⅡ组心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达表达明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);与AngⅡ组比较，漆黄素1组、漆黄素2组、漆黄素3组心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达明显降低，且随着漆黄素浓度升高，IL-33、ST2表达呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05,表3,图8)。

3、讨论

心血管疾病是威胁人类健康的一种主要疾病，心肌纤维化能够破坏心肌结构，导致心肌紊乱和血管功能障碍，促进心脏疾病向慢性心力衰竭发展。心肌纤维化主要是胶原合成增加以及间质和血管周围间隙过度弥漫性胶原积聚[9]。心肌成纤维细胞是导致心肌纤维化的主要细胞之一，在细胞传导因子和机械应力等因素刺激下，心肌成纤维细胞过度活化导致Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达增加，构成心肌纤维化发病的基础[10]。心肌促纤维化生长因子转化生长因子β、AngⅡ等与其受体结合，触发信号传导途径和转录因子激活，如丝裂原活化蛋白激酶、NF-κB等，表达更多的α-SMA,α-SMA是成纤维细胞活化的标志[11]。本研究结果表明，AngⅡ处理后，心肌成纤维细胞活力、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达均明显升高，提示AngⅡ处理促进心肌成纤维细胞活化。

漆黄素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜(西红柿、黄瓜等)、水果(草莓、苹果等)中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗血管生成、神经保护和心脏保护等作用。Dong等[12]研究表明，漆黄素可在体外抑制压力超负荷引起的心肌肥大，改善体内心脏功能并抑制苯肾上腺素引起的心肌肥大。Choi等[13]研究表明，漆黄素能够减轻高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝纤维化和胰岛素抵抗。本研究结果表明，漆黄素能够降低心肌成纤维细胞活力、α-SMA、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达，且呈剂量依赖性降低，提示漆黄素可能通过抑制心肌成纤维细胞活化抑制心肌纤维化。

IL-33是来自IL-1家族的组织源性核细胞因子，存在于内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞中，在稳态和炎症过程中大量表达[14,15]。ST2属于IL-1受体/Toll样受体超家族，在IL-1受体辅助蛋白作用下与IL-33特异性结合[16,17]。ST2有3种剪切异构体，跨模型ST2,分泌型ST2以及多变型ST2,IL-33主要与跨模型ST2和分泌型ST2结合，在各种疾病以及器官纤维化过程中发挥作用[18]。Tseng等[19]研究表明，心力衰竭患者心肌组织中IL-33、ST2表达与心脏纤维化显著相关。Wang等[20]研究表明，微小RNA-487b通过抑制IL-33/ST2信号通路，缓解慢性心力衰竭大鼠模型的炎性反应和纤维化。IL-33与心肌细胞膜上跨模型ST2结合有利于细胞存活和完整性，而在心肌纤维化过程中，分泌型ST2增加会导致IL-33与分泌型ST2结合，从而阻止IL-33与跨模型ST2结合，促进组织纤维化发生[21]。本研究结果表明，AngⅡ组心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达明显高于对照组，提示IL-33/ST2信号通路可能参与心肌纤维化。本研究结果还表明，漆黄素能够降低心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达，且呈剂量依赖性降低，提示漆黄素可能通过抑制IL-33/ST2信号通路来降低心肌成纤维细胞活化，从而阻止心肌纤维化发展。然而，本研究仅发现漆黄素能够降低心肌成纤维细胞IL-33、ST2表达，具体作用通路有待深入研究。

综上所述，漆黄素能够降低AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞活化和抑制IL-33/ST2信号通路，可能是心肌纤维化的潜在治疗药物。然而，本研究仅从细胞水平分析漆黄素的可能效应，下一步需结合大鼠实验，进一步分析其在心肌纤维化治疗中的意义。

参考文献:

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文章来源：李晓丽,周素平,曾淑敏,赵春丽,李金顺,李海涛.漆黄素对血管紧张素Ⅱ诱导心肌成纤维细胞活性的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2021,23(11):1195-1199.