摘要:目的考察芙蓉凝胶对LPS诱导急性乳腺炎大鼠乳腺组织MPO表达及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平的影响,并探讨其抗炎作用可能的机制。方法取分娩后雌鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、阳性组和芙蓉凝胶低、高剂量组。在大鼠第4对乳腺处,空白组、假手术组、模型组贴空白凝胶,阳性组和芙蓉凝胶高、低剂量组贴相应药物。每天给药1次,连续4 d。第5天,假手术组注入灭菌PBS溶液,模型组、药物组注入LPS溶液,造模后,再给药1次。给药24 h后,取各组大鼠乳腺组织,观察其病理学变化情况,采用免疫组化法检测组织中MPO表达,采用酶联免疫吸附测定法检测组织IL-1β、IL-6、TNF-α的水平,用熵权法计算综合评分,以此评价芙蓉凝胶对急性乳腺炎模型大鼠的综合影响。结果与空白组比较,模型组MPO表达及炎症因子水平升高(P<0.01);与模型组比较,阳性组和芙蓉凝胶高剂量组MPO表达及炎症因子水平均降低(P<0.01)。熵权法计算得阳性组、芙蓉凝胶低剂量组、芙蓉凝胶高剂量组综合评分分别为0.565、 0.083、 0.352。结论芙蓉凝胶对LPS诱导急性乳腺炎大鼠有一定保护作用,且高剂量组作用强于低剂量组,其作用机制可能与抑制大鼠乳腺组织MPO表达有关。
急性乳腺炎是乳腺的急性化脓性感染,好发于产后哺乳的妇女,尤以初产妇更为多见,往往发生在产后3~4周[1]。因乳房血管丰富,早期就可出现寒战、高热及脉搏加快等脓毒血症表现。西医主要通过抗生素等药物治疗和穿刺或引流等手术治疗该疾病,预后较好。但对于哺乳期的妇女使用抗生素,其孩子会出现一些菌群失调、腹泻等症状[2],而手术治疗会对乳腺外形造成不可修复的损伤。中医以清热解毒、消肿排脓为主[3,4],临床上用乳腺宁搽剂治疗急性乳腺炎,效果显著。其药物组成有木芙蓉叶和穿心莲。由于搽剂存在施药不方便,药液易于流淌的缺陷,课题组前期将其制备成芙蓉凝胶剂,具有使用方便、贴敷舒适、刺激性小、患者依存性高、载样量大等优势。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导急性乳腺炎大鼠为对象,通过观察大鼠乳腺组织病理切片,检测其乳腺组织中相关炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平和髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)的活性,从炎症因子和分子蛋白水平等方面探讨芙蓉凝胶对LPS诱导急性乳腺炎大鼠的保护作用及可能机制,并借助信息熵理论综合评价不同剂量芙蓉凝胶对上述指标的影响,以期为外用新剂型的研发和临床应用提供实验依据。
1、材料
1.1动物
SD大鼠,体质量250 g,购于长沙市天勤生物技术有限公司,实验动物生产许可证号SCXK(湘)2014-0011。给予充足的水和鼠饲料,自由饮水摄食,适应性饲养1周后,雌雄鼠按2∶1的比例同笼饲养,当雌鼠有明显孕相后,将雄鼠移出,待雌鼠自由产仔。
1.2药物与试剂
空白凝胶膏剂、芙蓉乳腺宁凝胶膏剂(自制,符合凝胶膏剂要求);乳腺宁贴(批号201804092,桂林市威诺敦医疗器械有限公司)。脂多糖(批号044M4000V,美国Sigma公司);苏木素(批号180634)及IL-1β、IL-6、TNF-α酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(批号1218E18)均购自南京赛博生物技术有限公司;灭菌PBS溶液(pH 7.2~7.4,批号20180829,北京索莱宝科技有限公司);MPO兔单克隆抗体[批号ab208670,艾博抗(上海)贸易有限公司];山羊抗兔工作液(批号SP-9001)、正常山羊血清(批号ZLI-9021)、浓缩型DAB试剂盒(批号K135925C)均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。水合氯醛(批号2015050501,成都市新科龙化工试剂厂);75%乙醇(批号180826,贵州康泰利健消毒制品有限公司);4%多聚甲醛(批号1804895,兰杰柯科技有限公司)。
1.3仪器
BCD-201STPA型冰箱(青岛海尔股份有限公司);Multlskan Mk3型酶标仪[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司];-80℃冰箱(青岛海尔特种电器有限公司);徕卡-2016型转轮式切片机(德国Leica公司);TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司);BA400Digital型数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。
2、方法
2.1造模
参考文献[5]报道,选取分娩后5~7 d,乳头管明显膨大、完整性好的雌鼠,4%水合氯醛麻醉(0.75 mL/100 g)后固定在手术台上,用剪刀将大鼠第4对乳腺周围的毛小心剔除(不可剪破鼠皮),面积7 cm2左右,并用医用胶带、铁丝网、纱布固定大鼠腹部,使其松紧适度,不影响饮水摄食,连续4 d。第5天将大鼠麻醉,固定在手术台上,用75%乙醇对第4对乳腺周围消毒,用镊子将该处乳头轻轻调起,使其充分暴露,左手拿小镊子轻轻夹起并固定,右手用剪刀小心剪掉乳头管尖端1 mm左右,用100μL钝性微量进样器往大鼠每侧乳头管缓慢灌注100μL 1 mg/mL LPS,停留数秒后,将微量进样器缓慢拔出,用棉签轻揉乳腺周围,使LPS均匀分布。
2.2药物制备
根据课题组前期均匀试验优选出的最佳基质处方(NP700 0.100 0 g、高岭土0.500 0 g、甘油4.146 7 g、PVP 0.398 2 g、酒石酸0.004 0 g、甘羟铝0.040 0 g,水4.000 0 g),加入3%丙二醇促渗剂,制得空白凝胶膏剂[6]。课题组前期以君药木芙蓉叶临床剂量的8倍,即每天1.7 g/kg为有效剂量换算成小鼠总剂量[7,8],用等比基线法设定木芙蓉、穿心莲不同配比,进行镇痛抗炎实验[9],确定两者最佳配比为1∶1,分别以空白凝胶膏剂中载10%、1.25%的木芙蓉叶与穿心莲纯化物为高、低剂量组[6]。
2.3分组与给药
分组前1 h将幼鼠与母鼠分开,将雌鼠随机分为空白组(0 g/kg)、假手术组(0 g/kg)、模型组(0 g/kg)、阳性组(1 g/kg)和芙蓉凝胶低(2 g生药/kg)、高剂量组(16 g生药/kg),每组10只,空白组、假手术组、模型组均于大鼠第4对乳腺贴空白凝胶,阳性组贴乳腺宁贴,芙蓉凝胶组贴相应的药物,每天1次,连续4 d,第5天模型组、给药组大鼠按“2.1”项下方法处理,空白组不做任何处理,假手术组大鼠缓慢注入灭菌PBS溶液(100μg/侧),造模后各组大鼠再给药1次。
2.4取材
造模24 h后大鼠脱颈处死,固定在手术台上,75%乙醇擦拭第4对乳腺周围,剪刀小心大鼠腹部(切勿剪破腹膜),剥开皮肤以使乳腺充分暴露,剥离组织,左侧用4%多聚甲醛固定,用于后期制作病理组织学切片和免疫组化切片;右侧迅速转移至-80℃冰箱保存,用于IL-1β、IL-6、TNF-α水平的检测。
2.5病理切片制备和HE染色
流水冲洗固定好的大鼠乳腺组织,梯度乙醇脱水,依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中直至呈透明状态,石蜡包埋,切片,烘干,脱蜡,进行HE染色和封片,在显微镜下观察病理组织变化。
2.6 MPO表达检测
大鼠乳腺组织经脱水、透明、石蜡包埋、切片、烘干、脱蜡后,滴加山羊血清封闭液进行抗原修复并阻断内源性过氧化物酶,加入MPO抗体,在4℃湿盒中孵育过夜,加入酶标二抗,室温孵育20 min, DAB显色液显色,终止显色后苏木素复染,脱水后封片,镜检,采用数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集,Image-Pro Plus 6.0图像分析系统检测光密度(OD)和面积,计算每张图像平均OD值,用以表述MPO表达。
2.7 TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测
将右侧大鼠乳腺组织取出后,按1∶9的比例加入PBS溶液,组织匀浆机匀浆后离心15 min,弃去上层乳白色脂肪部分,收集上清液,采用ELISA试剂盒检测组织上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。
2.8统计学分析
2.8.1方差分析
通过SPSS 16.00软件进行处理,数据以(x¯±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2.8.2熵权法分析
通过Excel 2003软件进行熵权法分析。参考文献[10,11,12,13]报道,将模型组和各给药组数据的平均值(V)进行标准化处理,公式为V标准化值=|V给药组-V模型组|,建立原始药效指标矩阵(Xij)mn,其中i表示实验数,j表示指标数,再将(Xij)mn转换为概率矩阵(Pij)mn,公式为Pij=Xij/∑nPij,其中Pij表示第j次实验在i指标下的概率,计算各药效指标信息熵值(Hi),公式为Hi=∑nPij⋅lnPij/lnn,并赋予相应权重(Wi),公式为Wi=(1−Hi)/∑m(1−Hi),计算综合评分(M),第m组n个指标的公式为Mm=P1 mW1+P2 mW2+…+ PnmWn,M值越大,对相应药效指标的综合影响越大。
3、结果
3.1大鼠乳腺组织病理组织学变化
空白组和假手术组大鼠乳腺小叶结构较为明显,未见其他明显病理变化;模型组大鼠乳腺组织病变严重,乳腺小叶结构较为明显,腺泡数量较为正常,导管管腔内有大量中性粒细胞渗出;阳性组大鼠乳腺小叶结构较为明显,导管及腺泡管腔内有少量中性粒细胞渗出,未见其他明显病理变化;芙蓉凝胶低剂量组乳腺小叶结构较为明显,导管管腔内有较多中性粒细胞渗出;芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺小叶结构明显,导管上皮细胞形态及腺泡数量较为正常,导管管腔内有少量中性粒细胞渗出,见图1。与空白组比较,模型组大鼠炎症反应及乳腺、导管等细胞损伤明显增强;与模型组比较,阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠病变程度相对较轻,芙蓉凝胶低剂量组作用一般,提示阳性组、芙蓉凝胶高剂量组对急性乳腺炎模型大乳腺组织有较好改善作用。
图1大鼠乳腺组织病理图(HE,×400)
3.2大鼠乳腺组织MPO表达
表1显示,模型组大鼠乳腺组织MPO表达升高(P<0.01);与模型组比较,阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺组织MPO表达均降低(P<0.01),芙蓉凝胶低剂量组无明显变化(P>0.05)。
3.3大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平
与空白组比较,模型组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01);与模型组比较,阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01),见表2。
表1各组大鼠乳腺组织MPO表达(x¯¯±s,n=10)
表2各组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平(pg/mL,x¯¯±s,n=10)
3.4药效评价
对上述指标数据进行标准化处理,结果见表3,以其建立原始药效指标矩阵(X)后转换为概率矩阵(P),见图2,再根据概率矩阵计算第i个指标的熵值(Hi),得Hi=[0.700 8, 0.954 9, 0.949 8, 0.955 4],计算各指标的权重系数(Wi),为[0.681 4, 0.102 7, 0.114 3, 0.101 6],阳性组、芙蓉凝胶低剂量组、芙蓉凝胶高剂量组的M值分别为0.565、0.083、0.352,可知芙蓉凝胶高剂量组综合影响较大,低剂量组影响较小。
表3各组指标数据标准化处理结果
4、讨论
LPS诱导的炎症可使TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高,且TNF-α、IL-1β能够调节嗜中性粒细胞的渗出,造成乳腺组织损伤,而MPO的表达和分布与嗜中性粒细胞的数量成正相关[14,15],故本实验选用TNF-α、IL-1β和IL-6指标评价芙蓉凝胶对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠的影响。经芙蓉凝胶干预后,大鼠乳腺组织MPO的表达降低,高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平受到抑制,即对急性乳腺炎大鼠有较好的保护作用。
熵在信息论中,表示不确定性的量度[16]。熵权法以信息熵理论为依据,客观地对各因素赋权,进行综合评分,可为多指标研究数据分析提供依据[17]。在药物效应评价试验数据处理中,利用信息熵理论对多个效应评价指标进行客观赋权,建立综合评价度量指标,其综合评分能直观清晰反映不同剂量组药物对多个效应指标的综合影响,同时也避免了各指标数据间的相互影响,提升实验研究的科学性与严谨性[18,19]。本研究借助信息熵理论,以炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及MPO表达为药效评价指标,最终建立综合药效评价度量指标,考察不同剂量芙蓉凝胶对大鼠MPO表达及炎症因子水平的综合影响。通过熵权法公式计算各指标的信息熵值,指标的信息熵越小,该指标提供的信息量越大,权重就越高,在综合评价中所起作用越大[20]。熵权法计算得MPO信息熵最小,说明该因子在综合评价中所起作用最大,在对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠进行药物效应评价时,选择以MPO表达为评价指标具有一定可靠性。经芙蓉凝胶干预后,高剂量组MPO免疫组化检测OD值降低(P<0.01),即MPO的表达被抑制。熵权法综合评分结果显示,各药效指标的综合评分阳性组最高,芙蓉凝胶高剂量组次之,芙蓉凝胶低剂量最低,表明芙蓉凝胶对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠有一定改善作用,其机制可能与抑制大鼠乳腺组织MPO表达有关。
参考文献:
[1]吴靓,万华.急性乳腺炎初期的中医治疗进展[J].中国中医急症,2014,24(8):1498-1501.
[2]李逸梅,龚旭初.中医药治疗哺乳期早期急性乳腺炎的研究进展[J].中国中医急症,2019,28(7):1310-1312.
[3]贺建红,储军.中药内服外敷配合艾灸治疗急性乳腺炎46例[J].实用中医药杂志,2013,29(8).638-639.
[4]师记恩.自拟解毒化瘀消结汤治疗急性乳腺炎的临床效果[J].河南医学研究,2019,28(21):3967-3968.
[5]解颖颖,胡学权,崔京春,等.脂多糖诱导哺乳期SD大鼠乳腺炎模型的建立[J.动物医学进展,2017,38(2):46-50.
[6]杨晓梅,陈晓兰,杨敬鸿,等.乳腺宁凝胶有剂的制备工艺及质量标准研究[J].贵阳中医学院学报,2018,40(3).41-45.
[7]符诗聪,张慧娟,马景,等.木芙蓉叶有效组分致突变与急性毒性实验研究[J].广西科学,2002,9(1):53-56.
[8]叶勇,覃妮,庾茜,等.壮药战骨总黄酮提取物经皮给药对大鼠/小鼠的抗炎、镇痛作用研究[J].中国药房,2018,29(15):2090-2094.
[9]张龙,林珠灿,张睿卓,等.基于基线等比增减法的养心草配伍酸枣仁安神药效的实验研究[J].海峡药学,2015,27(1):17-18.
[10]王仁杰,李淼,闫明,等.信息嫡理论在热毒宁口服制剂中金银花与栀子提取工艺优选中的应用[J].中草药,2015,46(5):683-687.
[11]庞汉青,唐于平,史旭芹,等基于主成分分析和多指标综合指数法丹参不同有效部位的活血化瘀作用比较[J].中草药,2016,47(18):3239-3247.
[12]郑鹏,赵昭,李佳佳,等.气滞胃痛颗粒中挥发性成分提取工艺的优化[J].中成药,2019,41(6):1214-1218.
[13]权亮,赵永峰,陈志敏,等基于信息嫡赋值法的正交联用BO:-Behnken设计-响应面法优化黄丝郁金醋炙工艺研究[J.中草药,2018,49(8):1823-1828.
[14]李德朋.大黄素对LPS诱发的小鼠乳腺炎性损伤保护效果的研究[D].长春:吉林大学,2013.
[15]李玉,贺胜男,丁娜娜,等.穿心莲内酯对LPS诱导的小鼠乳腺炎的抗炎作用[J.中国兽医科学,2017,47(9):1200-1206.
[16]张东,张宁.物理学中的嫡理论及其应用研究[J].北京联合大学学报(自然科学版),2007,21(1):4-8.
[17]王星星,李淼,康小东,等.基于信息嫡赋权法优化哮喘方醇提工艺[J].中成药,2017,39(7):1391-1394.
[18]杨敬鸿,陈晓兰,杨晓梅,等.基于信息嫡理论和方差分析比较猪牙皂不同组分对小鼠缺血缺氧及血脑屏障通透性影响[J]中药药理与临床,2018,34(6).83-86.1.
[19]杨晓梅,陈晓兰,张永萍,等基于信息嫡理论比较不同剂星雪上一枝蒿总生物碱对CIA模型大鼠的改善作用及其机制[J].中国药房,2019,30(16):2206-2209.
[20]靳瑞婷,陶永华,李雪峰,等.芪白平肺颗粒中人参和黄芪提取工艺的优化[J].中成药,2016,38(4):795-800.
文章来源:万静,陈晓兰,杨晓梅,杨敬鸿,韩伟,高远.芙蓉凝胶对急性乳腺炎大鼠的抗炎作用及机制[J].中成药,2021,43(12):3321-3325.
分享:
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种与肥胖、胰岛素抵抗和血脂异常有关的多系统疾病,又称代谢相关脂肪性肝病(metabolic associated fatty liver disease,MAFLD),是指排除酒精等明确的肝损害因素,以弥漫性肝细胞大泡性脂肪病变为主要特征的临床病理综合征,其临床疾病谱发展包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化和肝细胞癌[1]。
2024-04-23在我国,脑卒中是成年人致死、致残的首位病因[1,2]。中国卒中报告[3]指出,近30年,我国缺血性卒中的发病率增加了34.7%。目前急性缺血性卒中的治疗关键为恢复缺血脑组织的血流再灌注,逆转缺血半暗带,主要手段为静脉溶栓和血管内治疗[4]。
2024-04-21糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病,其主要原因是胰岛素分泌障碍或胰岛素耐受性降低,糖尿病将导致内脏器官受损,并引发一系列并发症,甚至威胁生命[1,2]。糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病的主要微血管并发症之一,患病人数约占糖尿病患者的30%~40%[3,4]。
2024-04-19脓毒症是一种由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)感染导致的全身感染的复杂综合征,可引发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)[1,2]。在LPS诱导的ALI小鼠模型中,抑制细胞凋亡可降低ALI程度[3]。提示LPS诱导细胞凋亡的机制是制定ALI保护性治疗策略的关键。自噬是一个保守的循环系统,参与异常细胞器和大分子的稳态转换[4]。
2024-04-19吗啡是目前临床上最常用的作用于中枢神经系统的强效镇痛药物,是阿片类药物的一种,也是目前临床应用最广泛的成瘾物质,研究发现吗啡可以导致多个系统和器官的细胞死亡和凋亡[1,2]。因此吗啡在发挥镇痛效应的同时,也会诱导神经元的凋亡[3,4,5]。甘草苷作为甘草水提液中一个黄酮类化合物,其分子式为C21H22O9,甘草苷药效显著,具有抗溃疡、抗病毒、抗抑郁等作用[6,7,8,9]。
2024-04-18线粒体是细胞内的细胞器,在能量代谢中起着至关重要的作用,大多数细胞能量是通过线粒体代谢途径获得的。神经元是脑组织中控制代谢过程的主细胞,对能量的需求很高[1]。由于神经元的再生能力很小,因此神经元功能障碍引起的疾病通常很难治疗,而线粒体可能成为治疗神经退行性疾病(Neurodegen‐erative Diseases,ND)的重要靶点[2]。
2024-04-15溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因不明的非特异性炎性疾病,病变主要累及结、直肠黏膜和黏膜下层。临床症状主要表现为腹痛、腹泻、黏液脓血便、里急后重。该病迁延难愈,并有一定的癌变率,是公认的难治性疾病之一[1]。UC发病机制尚不明确,目前西药以美沙拉嗪、糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗为主,由于副作用大或部分患者效果不佳等原因,限制了其临床应用[2]。
2024-04-15椎间盘是由纤维软骨组成的无血管组织,其退变是慢性腰痛的主要原因,可导致严重的残疾。椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD)伴有多种病理改变,包括细胞外基质结构改变、髓核细胞缺乏、炎症反应和衰老细胞数量增加[1]。目前,IVDD的治疗方式包括保守治疗和手术干预,但这些策略缺乏预防疾病进展和恢复椎间盘功能的能力[2]。
2024-04-14根据流行病学调查结果显示,在50岁以下人群中,椎间盘退行性变(intervertebral disc degeneration, IDD)的发病率男性为71%,女性为77%,在50岁以上人群中,两性均>90%。IDD是引起下腰痛的主要原因之一[1]。现代医学治疗IDD引起的疾病,主要有保守与手术治疗两种方式,保守治疗给予镇痛药、物理治疗和消炎药等以减轻疼痛。对症状药物无反应的患者可采用手术治疗来帮助缓解症状[2]。
2024-04-14恶性肿瘤严重危及人类生命健康。目前,手术切除、化疗、放疗等传统治疗方式的抗癌疗效并不理想,寻找新的诊疗模式迫在眉睫。免疫治疗已经成为继传统治疗方式之后的一种新型抗肿瘤手段,其机理主要是在免疫学理论的指导下,采取重定向、基因编程等手段,激活人体自身免疫系统,靶向肿瘤细胞进而治疗肿瘤[1,2]。
2024-04-12人气:16726
人气:14121
人气:13210
人气:13012
人气:11606
我要评论
期刊名称:山西中医
期刊人气:4379
主管单位:山西省卫生健康委员会
主办单位:山西省中医药学会,山西省中医药研究院
出版地方:山西
专业分类:医学
国际刊号:1000-7156
国内刊号:14-1110/R
邮发代号:22-30
创刊时间:1985年
发行周期:月刊
期刊开本:大16开
见刊时间:4-6个月
影响因子:1.881
影响因子:1.074
影响因子:1.483
影响因子:0.495
影响因子:0.498
400-069-1609
您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!
你的密码已发送到您的邮箱,请查看!