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三黄颗粒对α-萘异硫氰酸酯诱导胆汁淤积大鼠肝损伤保护作用的研究

2022-07-08 165 上传者：管理员

摘要：目的:探究三黄颗粒对α-萘异硫氰酸酯诱导胆汁淤积性大鼠肝损伤的保护作用。方法:将72只SD大鼠随机分为6组，正常对照组、模型组、阳性对照组和三黄颗粒低、中、高剂量组，每组12只，隔日1次ANIT灌胃造模，各组连续灌胃给药4周，取血并采集肝脏标本。放射免疫法检测LA、HA、PC-Ⅲ、IV-C值;全自动生化分析仪检测大鼠血清肝功能生化指标;切取大鼠肝中叶，制作病理组织切片，光学显微镜下观察。结果:三黄颗粒组大鼠肝功能指标较模型组均不同程度的降低;肝脏纤维化指标有明显的改善;大鼠肝HE染色切片得出，高、中、低剂量组之间存在差异，肝脏形态改善明显。结论:三黄颗粒可减轻α-萘异硫氰酸酯诱导胆汁淤积性大鼠肝损伤病理变化，改善肝功能，减轻肝脏纤维化，中等剂量疗效较好。

关键词：
α-萘异硫氰酸酯
三黄颗粒
大鼠
肝功能
肝纤维化
胆汁淤积症
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三黄颗粒，是根据中国传统验方“茵陈蒿汤”加减化裁而来，具有清利湿热退黄功效，主要用于孕妇预防胎儿及新生儿溶血症[1]。于本院经临床应用多年，深受广大医患的欢迎，临床疗效极佳。本科课题组经过多年研究，对三黄颗粒的质量标准、体外活性成分等进行了分析[2]，但其预防新生儿溶血的药理作用尚不清楚，此前有学者认为，肝功能尚未发育完全或新生儿自身对于胆红素代谢存在一定障碍时，具有免疫调节的T细胞呈现了负反馈调节[3,4]，胆红素不能发挥其抗氧化作用，导致多器官功能甚至结构性损伤，表现为新生儿面目黄染，查血可见诸多肝功能指标下降，甚至会导致新生儿肝脏纤维化和肝硬化。在中医学中，婴肝征属于湿热型黄疸，是综合性疾病，脾虚为主或外感疫毒肝胆运化失控，习称“黄疸”[5]。本课题组探讨三黄颗粒保护肝损伤的作用机制。

1、实验材料

1.1实验动物

SPF级SD系2周龄(相当于人幼儿期)大鼠72只，体质量(40±30) g，♀♂兼半，由北部战区总医院实验动物中心提供，动物实验许可证号:SCXK(辽) 2015-0001。

1.2实验药物

三黄颗粒:北部战区总医院，产品批号:20190505，主要成分为:茵陈、大黄、黄芩、黄柏、甘草，生药浓度4、6、8 g/kg;熊去氧胆酸胶囊:德国福克大药厂，批号:L19091A，规格:250 mg/粒，配制药物浓度5 g/L。

1.3实验试剂

α-萘异硫氰酸酯(ANIT):成都艾科达化学试剂有限公司，批号:201910251;丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)试剂盒:德国罗氏;碱性磷酸酶酶(ALP)、总胆红素(TNi L)、直接胆红素(DBiL)、间接胆红素(IBiL)、总胆汁酸(TBA)测定试剂盒:九强生物技术股份有限公司;肝脏组织层粘连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)、透明质酸酶(HA)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)检测试剂盒:天津原子能公司。

1.4实验仪器

Cobas C8000全自动生化分析仪:罗氏;UV-1700紫外分光光度计:日本岛津公司;TD5A台式多管架离心机:长沙英泰仪器有限公司;生物电子显微镜:OLYMPUS;D7100照相机:尼康;FA2004电子分析天平:上海天平仪器厂。

2、实验方法

2.1模型制备及分组处理

将72只SD大鼠随机分为6组，正常对照组、模型组、阳性对照组和三黄颗粒低、中、高剂量组，每组12只。除正常组外，其余各组均给予ANIT葵花籽油(20 g/L,0.6 m L/100 g)灌胃造模[6,7,8]，隔日1次，连续用药4周;正常组灌胃等量生理盐水。给予ANIT灌胃3次后，阳性组给予熊去氧胆酸(0.3 mg/100 g)灌胃，每天1次，三黄颗粒低、中、高剂量组给予不同浓度三黄颗粒溶液(4、6、8 g/kg)灌胃，每天1次;均给药4周;模型组、正常组给予等量生理盐水灌胃，每天1次，直至4周。

2.2观察指标

2.2.1血清AST、ALT、ALP、TBIL、IBIL、DBIL、TBA检测

末次给药后禁食水12 h，各组大鼠腹主动脉取血(取血前乙醚适度麻醉)，每只大鼠取血约3 m L，经3 000 r/min离心10 min，吸上清，-20℃保存备用。全自动生化分析仪测定大鼠血清AST、ALT、ALP、TBIL、IBIL、DBIL、TBA。

2.2.2肝组织纤维化指标检测

大鼠采血后立即断脊法处死大鼠，取肝脏，经低温盐水水洗后剪取1 cm×1 cm×1 cm大小的组织块;用乙二胺四乙酸二钠(0.01 mol/L)、三氨基甲烷Tris-HCL缓冲液(0.1mmol/L)、p H7.4灭菌蒸馏水、0.8%氯化钠溶液、0.01 mmol/L的蔗糖制备匀浆介质;将肝组织放入匀浆介质中，低温高速离心，取上清液，采用放射免疫法，检测LN、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值。

2.2.3肝组织病理学观察

选取肝中叶组织1 cm×2 cm×0.3 cm，石蜡包埋，切片机切片5μm，苏木-伊红染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察。

2.3统计学方法

数据处理采用SPSS17.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBA、TBIL、IBIL、DBIL比较

见表1。

表1各组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBA、TBIL、IBIL、DBIL水平比较

3.2各组大鼠肝组织纤维化指标比较

见表2。

3.3各组大鼠肝组织病理变化

正常对照组和阳性对照组:肝脏外观轮廓、颜色正常(粉褐色，状态饱满，边缘锐利，质地柔软，分叶清晰);显微镜下见肝脏组织结构完整，肝窦及肝小叶外观形态正常，肝细胞均匀分布，核大而圆，核膜清晰，胞质丰富，排列整齐有序。模型组:肝脏外观肿胀，形态不规则，分布不均匀，边缘圆钝，略显灰白色;显微镜下可见肝小叶轮廓不清，胆管增生，点片状坏死，汇管区、肝小叶间可见管周围水肿，胆小管胆汁淤积，肝窦间、肝窦中炎症细胞较正常组和阳性对照组明显增多，肝细胞空泡，明显嗜酸性病变坏死。高剂量组:细胞形态规则，结构完整，可见轻度黄染;低剂量组:可见轻度黄染，肝脏小叶坏死少见，间隙增宽;高剂量和低剂量组可见纤维组织增生、炎症细胞浸润程度较模型组轻，小叶间胆管大致正常未见胆汁淤积。中剂量组与正常组极为相似，镜检见肝小叶间隙略有增宽，纤维组织增生不明显。见图1。

表2各组大鼠肝组织纤维化指标比较

图1各组大鼠肝组织病理学观察(HE，×40)

4、讨论

正常人肝功能完备时，可将体内胆汁经胆道运输，最终随粪便排出体外，但新生儿肝脏发育不完全、病理性损伤或ABO溶血症导滞肝细胞发生病变肿胀、肝小胆管管腔闭塞，形成胆汁淤积，过多的胆红素不能顺利地排出体外，最终形成各种胆汁淤积性疾病，临床表现为新生儿黄疸。ANIT是肝毒性物质，作用于肝细胞和胆管上皮细胞[9]，可诱发大鼠胆汁淤积性肝损伤，病理状态及临床表现与人类胆汁淤积性黄疸相似[10]。本研究中，大鼠造模后出现肛周、眼角黄染，排尿金黄色，造模大鼠血清生化指标AST、ALT、TBIL、DBIL、IBIL、ALP、TBA及肝组织匀浆肝纤维化指标LN、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值明显高于正常组，说明造模成功。

三黄颗粒加减化裁于《伤寒论》的茵陈蒿汤，由茵陈、大黄、甘草等5味中药组成，方中君药茵陈，主入肝经，有良好的利胆退黄功效[11]，其主要成分绿原酸是一种挥发油，可以促进胆汁分泌;大黄为泻下药之要药，其主要成分大黄酸和大黄素，通过泻下作用阻碍胆红素经过肝肠循环，从而降低胆红素的吸收率。全方使湿热疫毒从二便去从而使黄疸消退[12]。临床广泛应用于黄疸的治疗，作为院内制剂应用多年，功效清利湿热退黄，对于孕妇预防胎儿及新生儿溶血症具有显著疗效。

ALT与AST广泛分布于肝细胞内，对于肝细胞受损有着很高的敏感性[13]，临床上是常用的肝功能指标。ALP是诊断胆道系统疾病常用的指标;TBIL也是判断黄疸程度的主要指标;ALP为一种含锌的蛋白，为膜性结合酶，几乎存在于机体的各个组织，主要分布于肝细胞的血窦侧和毛细血管侧的微绒毛上，正常情况下血清中的ALP经血液到肝脏，经胆道排泄，胆汁排出不顺畅致毛细胆管压亢进时，ALP明显升高[14,15,16]。三黄颗粒高、中、低剂量组大鼠血清AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA均较造模组降低;说明三黄颗粒具有利胆退黄作用，能够改善病理黄疽大鼠的肝脏损伤。高、中、低剂量组组间相比较，大鼠血AST、ALT、ALP、TBIL、DBIL、IBIL、TBA值表现出明显差异，中剂量组所得结果与正常对照组无明显差异。模型组肝脏纤维化指标LA、HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C值均有升高，高、中、低剂量组LA、HA、PC-Ⅲ及Ⅳ-C值低于模型组，而高、中、低剂量组之间也存在差异，肝脏形态改善明显;均说明三黄颗粒能够改善大鼠胆汁淤积所导致的肝脏损伤，改善肝脏纤维化程度。

本文实验结果表明:三黄颗粒具有利胆退黄的作用，中等剂量疗效较好，同时可减轻黄疸性疾病引起的肝脏病理损伤，减轻肝纤维化。

参考文献：

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文章来源：赵薇,赵庆春.三黄颗粒对α-萘异硫氰酸酯诱导胆汁淤积大鼠肝损伤保护作用的研究[J].中国中医药科技,2022,29(04):550-553.