葡萄是世界重要的果树树种之一,其栽培面积和产量仅次于柑桔,位居第二[1]。葡萄广泛分布于世界各大洲,南北纬30°～50°被认为是世界葡萄栽培的优势区域。葡萄也是我国五大果树(葡萄、苹果、柑橘、梨及桃)树种之一,在我国果树中栽培面积列第6位、产量列第5位[2];其种类品种繁多,我国原产的葡萄属植物的种类有38个种、1亚种和7个变种[3]。随着对葡萄资源的利用与开发,中国收集、保存的葡萄品种逾2000个[4],这些葡萄品种资源来源有3个渠道:传统品种、引进品种以及中国自行选育品种[5]。从来源上分析,现有葡萄栽培品种中多数为欧亚种,其次为欧美杂交种,另外也有部分属于起源于北美的美洲种群相关种以及起源于东北亚的山葡萄、毛葡萄、刺葡萄等。在染色体层面,葡萄有二倍体、三倍体以及四倍体。不同种、不同染色体倍数的葡萄其形态特征均存在一定差异。

葡萄叶片是进行光合作用和蒸腾作用的主要器官[6],葡萄叶片通过一个突出叶柄来支持,用于捕获最佳的光能来进行光合作用,为果实生长发育及品质形成提供主要的养分来源。因此,葡萄叶片大小和形态的差异都直接影响到净光合作用强度,进而影响到浆果的发育和品质。葡萄的叶片形状也是反映葡萄品种特征的一个关键因子,不同的葡萄品种的叶片形状具有一定的差异[7]。葡萄叶片的主脉均从一点发出,在葡萄叶片的掌状排列中,一般具有5个主要叶脉(一些特殊葡萄叶片如中国野生葡萄、菱叶葡萄等除外),2个叶脉之间构成叶脉夹角。叶片的叶脉长度和夹角又塑造了叶片形状,如圆形、肾形、心脏形等。不同品种叶片的绒毛、颜色、轮廓、大小和锯齿都有差异[8]。不同品种、同一品种不同植株、同一植株不同枝条均可能发现叶片形态的差异。

近年来,许多学者从形态学[9]、孢粉学[10]、酶学[11]、分子生物学[12]等对葡萄进行分类和相关鉴定。在这些方法中,形态学又是其中较为简单、较为便捷的方法[13,14]。通过几十年的发展,叶片形态的信息获取变得更加简单:Galet叶形结构数值分析法利用度量性状来研究葡萄的亲缘关系,并在国际上得到广泛应用[15,16];扫描仪、相机的运用使叶片图像的获取更精确和自动化,并且出现了专业叶形分析软件,如SuperAmpelos[17]、SHAPE、ImageJ等。许多学者通过叶片形态的分析方法,进行未知品种的开发[7]、亲缘关系的研究[18,19]以及品种之间的判别[20,21]。但关于我国现有栽培的育成葡萄品种的叶片形态多样性分析还鲜有报道。该研究将利用葡萄叶形分析软件SuperAmpelos对342个品种的叶片进行度量性状的测量,并且根据《葡萄种质资源描述规范和数据标准》[22]进行非度量性状的描述。通过度量性状的测量以及非度量性状的描述以此准确定义不同葡萄品种叶片的特性,来评价不同葡萄品种叶片的多样性,并对其进行分类、整理、汇总,以期为进一步开发葡萄品种识别系统或软件奠定基础。

1、材料与方法

1.1试验材料

试验所用的葡萄成熟叶片样本均于2019年7月采自中国农业科学院郑州果树研究所葡萄资源圃,共计342个葡萄品种。采集的葡萄植株均为多年生植株,每个葡萄单株从中庸枝上基部起第6～9节随机取10片发育正常、无病虫害、无机械损伤且叶脉清晰可见的新鲜成熟叶片,并及时将采集好的叶片样本装回实验室。

1.2试验方法

1.2.1成熟叶片图形信息获取

将采集的样本进行压平,以便叶片能够保持平展,减小角度误差;利用三脚架调整并固定拍照的角度,减小光线对照片清晰度的影响;将成熟叶片置于灰色背景布之上,以保证照相机拍摄出的效果最佳,并使叶脉清晰可见;在样本右上方放置样本的品种名称对应的编号,并在样本的右方放置标尺,以便确定拍照的缩放比例。每个叶片样本拍摄其正面和背面,并保证叶面能清楚反映叶片颜色、叶片形状、裂刻数、裂刻深度、上裂刻形状、上裂刻基部形状、叶缘锯齿形状、叶柄洼基部形状等特征;叶背能清楚反映叶背绒毛特征、绒毛密度等特征。

1.2.2非度量性状的描述

根据《葡萄种质资源描述规范和数据标准》[22](表1)。对采集的葡萄叶片样本的叶片形状、裂刻数、裂刻深度、上裂刻形状、上裂刻基部形状、叶缘锯齿形状、叶柄洼基部形状、叶背绒毛特征共8个描述性状进行观察登记,并作为叶形鉴定参数。为便于统计与分析,赋予对应的数值编号。

表1非度量性状描述

1.2.3度量性状的测量

图像化获取后的叶片样本采用葡萄叶形分析软件SuperAmpelos测量叶片样本的主脉长L1、上侧脉长L2、下侧脉长L3、底侧脉长L4、叶宽W、主脉与上侧脉的夹角α、上侧脉与下侧脉的夹角β、下侧脉与底侧脉的夹角γ和叶面积S共9种叶形度量性状特征,见图1。按照A=L2/L1、B=L3/L1、C=L4/L1、r=L1/W、σ=α+β和ξ=α+β+γ进行叶片性状度量化比值计算,得到叶形数值特征值,从数学角度客观说明叶片的性状。

图1叶片的度量性状

1.3数据分析

利用MicrosoftExcel2013软件对342个葡萄品种的非度量性状所对应的数字编号和所测度量性状值进行整理与统计,并计算所测度量性状的最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数等指标,分析葡萄叶片性状的差异;利用SPSS20.0软件进行主成分分析。

2、结果与分析

2.1非度量性状统计与分析

根据《葡萄种质资源描述规范和数据标准》[22],对中国农业科学院郑州果树研究所葡萄资源圃中342个现有栽培的葡萄品种成熟叶片进行描述。叶片的形态特征差异是葡萄属植物中分类鉴定最常用的研究指标之一[23],该调查的葡萄叶片形状主要为楔形和五角形,心脏形、近圆形和肾形的叶片较少。但心脏形、近圆形的葡萄叶片在我国野生葡萄资源中十分丰富,如桑叶葡萄、华东葡萄[24];不同种类的成龄叶具有不同的裂片数和裂刻深度,该调查裂刻数主要为三裂和五裂,七裂及以上在以往报道中仅在我国野生葡萄种中出现;裂刻深度主要为浅28.53%、中38.62%、深31.41%、极深1.44%;上裂刻形状为开张28.53%、闭合14.12%、稍重叠47.84%、深度重叠9.51%,由于上裂刻形状会因为葡萄叶片过度成熟而高度重叠,会造成一定的误差;上裂刻基部形状有“U形”和“V形”,其中“V形”占46.69%;“U形”占53.31%%;叶缘锯齿形状为双侧凹2.31%、双侧直44.67%、双侧突37.18%和一侧凹一侧突15.85%;叶柄洼基部形状有“U形”和“V形”,其中“U形”占85.59%。茸毛特征是葡萄叶片描述的一个重要内容,许多葡萄叶背会有叶背茸毛,该研究所采集葡萄样本中,大多数为绵毛或无毛,仅有刺葡萄的叶背会有钩刺,秋葡萄的叶背呈腺毛状,略微呈红棕色。由此可见,该调查的342个葡萄品种的叶片的叶形丰富、复杂多样,在非度量性状上有一定的多样性。

表2成龄叶非度量性状的描述

2.2度量性状和数值特征值统计与分析

对342个葡萄品种叶片进行度量性状分析,其中叶片宽最大值为277.10mm,最小值为76.73mm,平均值为188.16mm,极值范围为200.37mm;主脉长的最大值为225.27mm,最小值为70.03mm,平均值为146.52mm,极值范围为155.24mm。叶宽和主脉长在一定程度上决定叶面积的大小,有利于形成葡萄叶片形态的多样性。此外,对342个葡萄品种的叶形数值特征值进行分析,上侧脉长L2与主脉长L1的比值A最大值为1.12,最小值为0.72,均值为0.88,极值范围为0.40,下侧脉长L3与主脉长L1的比值B的范围为0.59～0.89;底侧脉长L4与主脉长L1的比值C的范围为0.32～0.78,进行比值计算后的度量特征值的极值范围变小,更有利于在一定区间内赋予葡萄特殊代码来代表此品种[15,16]。其余部分叶形度量性状和叶形数值特征值见表3。

2.3度量性状的分布状态与变异程度

运用平均值和中位数的差异来反映性状数据的集散性,由表3可知,除底侧脉长之外,与叶片长度有关的叶宽、主脉长、上侧脉长、下侧脉长和叶面积的平均值和其中位数的差值均大于0.9,角度的度量性状差值均小于0.5,6个叶形数值特征值的差值均小于0.3。由度量性状的变异系数统计结果可知,葡萄叶片的度量性状和叶形数值特征值的变异系数范围为5.68%～31.35%,其中以叶面积的变异幅度最大,变异系数为31.35%,与叶片长度有关的度量性状的变异系数均大于16.51%,与角度有关的度量性状的变异系数在11.81%～15.53%,变异系数均小于叶片长度有关的度量性状,进行比值计算的4个数值特征值的差异不明显,变异系数最小。这些结果说明葡萄叶片度量性状的变异较为丰富,其中与叶片长度有关的度量性状的变异系数的变异程度较大,且通过比值计算能降低变异系数。

2.4度量性状和数值特征值的相关性

由表4可知,叶宽与主脉长、上侧脉长、下侧脉长、底侧脉、叶面积、主脉与上侧脉夹角α和上侧脉与下侧脉夹角β具有极显著相关性,而主脉长除与长度有关的度量性状有极显著正相关性以外,和叶形特征值A、C呈显著负相关(A=L2/L1、C=L4/L1)和角度有关的度量性状不相关;与角度有关的度量性状α、β、γ彼此之间呈极显著正相关。

2.5度量性状的主成分分析

利用SPSS20.0对葡萄叶形的9个叶形度量性状和6个叶形数值特征值进行主成分分析,由表5可知,第一主成分贡献率为37.170%,第二主成分贡献率为25.821%;第三主成分贡献率为14.195%,前3个主成分的累计贡献率达到77.186%。

主成分分析结果表明,第一主成分主要是由叶片长度构成的度量性状变异,包括主脉长L1、上侧脉长L2、下侧脉长L3、底侧脉长L4、叶宽W和叶面积S;第二主成分主要代表与角度相关的度量性状变异,包括:主脉与上侧脉夹角α、上侧脉与下侧脉夹角β、下侧脉与底侧脉夹角γ以及α、β之和σ与α、β、γ之和ξ;第三主成分主要代表长度之间的比值,包括上侧脉长与主脉长的比值A、下侧脉长与主脉长的比值B、底侧脉长与主脉长的比值C、主脉长与宽的比值r共4个叶形数值特征值。

表5主成分分析结果

3、讨论

形态性状研究是探讨植物遗传变异和多样性最直接、最基础的方法[25]。表型性状的测定是研究植物遗传变异的一种快捷途径,特别是在短期内对种质变异资源进行评价时,常作为一种重要的评价手段[26]。唐海霞等[27]通过对68个石榴品种叶片形态及质量等指标进行相关测定与比较分析来完善石榴种质资源描述规范;蒋冬月等[28]研究观察浙江野生樱花的50个形态性状对其进行形态变异评价。MIN等[29]利用形态学研究了59份中国野生葡萄品种,总结出中国野生葡萄叶片在叶柄窦的基本长度、比例、圆度、纵横比和角度等性状上具有显著的表型多样性。该研究中的342份现有栽培葡萄的品种的形态性状,包括叶片形状、裂刻数等8个非度量性状和叶宽、主脉长等9个度量性状,并对度量性状进行比值计算,得到6个叶形数值特征值。从叶片形状来看,主要为楔形和五角形,心脏形、近圆形和肾形的叶片较少,叶片多样性不显著。因此需要裂刻数、裂刻深度、主脉长等更多简单、易测量、较客观的形态性状参数来对植物叶片形态的多样性进行评价,叶片的特有形态特征可以在一定程度上代表该物种。在度量性状的测量中,叶脉的长度和角度是最传统且较准确的反映叶片形态的因子[30]。在该试验调查的342个葡萄品种的叶片中,主脉长70.03～225.27mm,叶宽76.73～277.10mm,表明叶片形态丰富多样。此外,叶脉的上侧脉、下侧脉和底侧脉的长度在一定程度上可以决定葡萄的叶片性状和叶面积,是描述叶片形态的重要指标。

变异系数表示性状离散程度,可在消除量纲的情况下间接反映不同个体或群体在不同性状上的变异程度,变异系数越大,则性状值离散程度越大[31]。杨为海等[32]通过对25份供试澳洲坚果种质叶片的5个数量性样状的变异系数分析,来说明澳洲坚果种质的叶片性状具有较为丰富的遗传多性。该研究中的342个葡萄叶片9个度量性状的变异系数存在较大的差异,均大于11.81%,说明葡萄叶片形态性状具有较为丰富的遗传多样性;其中,与叶片长度有关的度量性状如主脉长、叶宽、叶面积的变异系数均大于16.51%,说明与叶片长度有关的度量性状的变异程度较高,遗传性较丰富,可作为区别葡萄品种的关键因子。度量性状的相关性表明,叶宽除与下侧脉与底侧脉夹角γ之外均呈显著相关性,可见叶片宽不仅在一定程度上影响叶片形状,也会在一定程度上影响叶片的角度与脉长。而脉长与角度之间的相关性不显著。在主成分分析结果表明,第一主成分是与长度有关的度量性状如主脉长、叶宽、叶面积,第二主成分是与角度有关的度量性状如主脉与上侧脉夹角α,第三主成分是与叶片长度之间的比值有关的叶形数值特征值,与变异系数反映的性状离散程度类似。

对植物叶片形态进行描述时,选取更多简单的形态性状对叶片形态多样性描述会更加准确。该研究通过对8个葡萄叶片非度量性状的描述和对9个葡萄叶片度量性状的测量,并对度量性状进行比值计算,能较为准确的反映出葡萄叶片性状差异显著,变异幅度大,多样性丰富,以期为将来建立葡萄叶片形态数据库和开发相关叶片形态识别软件奠定基础。

参考文献：

[1]孔庆山,刘崇怀,潘兴,等.国内外鲜食葡萄发展现状､趋势､问题与对策[J].中国农业信息快讯,2002(7):3-6.

[2]国家统计局.中国统计年鉴[M].北京:中国统计出版社,2019.

[3]刘崇怀,冯建灿,姜建福.中国葡萄属植物形态学聚类分组研究[J].植物遗传资源学报,2011,12(6):847-852.

[4]刘崇怀,马小河,陈俊,等.葡萄种质资源研究与利用概况[C].北京:多年生和无性繁殖作物种质资源共享试点研讨会,2005.

[5]管雪强,王恒振,孙玉霞,等.中国葡萄品种资源概况[J].落叶果树,2014,46(1):1-7.

[6]聂继云,杨振锋,张红军,等.果树叶面积简易测定方法研究[J].天津农学院学报,2000(4):33-35.

[7]李若兰,熊闻,鞠延轮,等.野生刺葡萄叶片度量性状研究[J].西北林学院学报,2017,32(1):172-178,217.

[8]阮仕立.中国野生葡萄种质资源描述标准及其计算机管理的研究[D].杨凌:西北农林科技大学,2001.

[12]罗素兰,贺普超,郑学勤,等.中国野生葡萄遗传多样性的RAPD分析[J].植物学报,2001(2):158-163.

[13]张玉刚,郭绍霞.葡萄种质资源鉴定方法研究进展[J].江西农业学报,2005(1):70-74.

[14]王姣,刘崇怀,樊秀彩,等.葡萄种类和品种鉴定技术研究进展[J].植物遗传资源学报,2008(3):401-405.

[18]徐丰,石雪晖,杨国顺,等.湖南不同类型刺葡萄植物学性状研究[J].中外葡萄与葡萄酒,2010(3):8-12.

[19]祁栋灵,周庆阳,刘三军,等.利用叶形结构数值分析葡萄种质亲缘关系的研究[J].中国南方果树,2005(3):64-66.

[20]尹克林,梁武,诸葛宏庆.酿酒葡萄品种‘蛇龙珠’的叶形结构数值鉴别[J].园艺学报,1998(2):86-87.

[21]宋军阳,于大永,王西平.葡萄叶片数量化研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2015,43(2):142-148.

[22]刘崇怀,沈育杰,陈俊,等.葡萄种质资源描述规范和数据标准[M].北京:中国农业出版社,2006.

[23]苏聪聪.刺葡萄杂种形态学及分子鉴定[D].长沙:湖南农业大学,2018.

[24]程大伟,姜建福,樊秀彩,等.中国葡萄属植物野生种多样性分析[J].植物遗传资源学报,2013,14(6):996-1012.

[25]徐斌,彭莉霞,杨会肖,等.杜鹃红山茶叶片主要性状的遗传多样性分析[J].植物研究,2015,35(5):730-734.

[26]唐军荣,李斌,朱丽娜,等.滇杨多倍体苗期叶片形态及光合生理比较分析[J].林业科学研究,2016,29(1):103-109.

[27]唐海霞,冯立娟,王中堂,等.石榴品种叶片形态特征比较[J].山东农业科学,2019,51(3):40-44,48.

[28]蒋冬月,沈鑫,陈雅静,等.浙江野生樱花枝干及叶片形态变异分析[J].浙江农林大学学报,2019,36(4):723-732.

[31]顾晓燕,郭志慧,张新全,等.短芒披碱草异位保护群体的表型多样性研究[J].草业学报,2015,24(5):141-152.

[32]杨为海,曾利珍,曾辉,等.澳洲坚果种质资源叶片形态性状观测分析[J].热带作物学报,2020,41(1):69-76.

杨鑫,孙宇杰,周碧江,付文静,房玉林,孟江飞.中国现有葡萄品种叶片形态评价与分析[J].北方园艺,2021(01):23-29.

基金:国家自然科学基金资助项目(31801833,31801811);国家葡萄产业技术体系资助项目(CARS-29-zp-6)