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鉴定和搭建拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体情况分析

2020-06-02 480 上传者：管理员

摘要：为了筛选与拟南芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因AtCYS6相互作用的蛋白，构建其酵母双杂交诱饵表达载体。本研究利用PCR方法扩增得到拟南芥AtCYS6的基因片段，与诱饵载体pGBKT7连接构建诱饵表达载体，经双酶切以及测序检测验证重组载体构建成功后，通过醋酸锂法将诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6与空载体pGBKT7分别转化到Y2HGold酵母菌株，检测其是否有自激活能力以及对宿主酵母菌株是否有毒性作用。结果表明：经PCR扩增后得到了AtCYS6基因，成功构建了无自激活和没有毒性的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6。本研究结果可进一步为筛选与AtCYS6相互作用的蛋白质及功能研究提供科学依据。

关键词：
分子生物学
半胱氨酸蛋白酶抑制剂
拟南芥
活性物质
诱饵表达载体
酵母双杂交
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半胱氨酸蛋白酶抑制剂，又被称之为巯基蛋白酶抑制剂，是动植物体内一种重要的活性物质，它可以通过与半胱氨酸蛋白酶活性位点结合进而起到抑制其活性的作用。半胱氨酸蛋白酶抑制剂最开始在昆虫、动物中的研究比较多(马冬梅等,2003)，随着研究的不断深入，一些植物中半胱氨酸蛋白酶抑制剂也陆续的被发现和报道。

半胱氨酸蛋白酶抑制剂在动植物体内起着重要的作用。有研究表明，半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以通过调节种子中蛋白质的动态平衡起到保护种子免受真菌、昆虫等的侵害作用。一些研究也表明，它可以通过提高其在植株中的表达量起到延缓植株衰老的作用。同时研究还发现，在程序性细胞死亡过程中，半胱氨酸蛋白酶抑制剂也起着协同调控的作用。另外，在逆境胁迫方面。研究表明，植株体内通过增加半胱氨酸蛋白酶抑制剂的表达量可以提高植株对病菌、低温、干旱等逆境胁迫的抵抗能力。

在本研究中，为了阐明拟南芥AtCYS6基因应对非生物逆境胁迫的功能机理，采用PCR技术得到拟南芥AtCYS6序列，对构建的诱饵表达载体进行自激活活性和对酵母菌株的毒性检测实验，以期为之后筛选与AtCYS6相互作用的蛋白提供研究基础。

1、结果与分析

1.1AtCYS6基因的扩增

本研究利用设计的引物进行PCR扩增反应和琼脂糖凝胶电泳，得到了大小约为730bp的扩增条带(图1)，与预期大小相符。因此，成功得到了拟南芥AtCYS6基因序列片段。

1.2pGBKT7-AtCYS6诱饵表达载体构建及鉴定

本研究首先利用特异性引物AtCYS6-F和AtCYS6-R对构建的诱饵载体进行扩增，然后对构建好的诱饵表达载体用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切进行鉴定，得到大小两条条带，与预期片段大小相符，可见插入片段大小正确，表明诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6构建成功(图2)。

1.3诱饵表达载体转化酵母Y2HGold菌株

将诱饵表达载体转入Y2HGold酵母菌株中，单克隆接种于SD/-Trp(色氨酸)液体培养基，30℃振荡培养24h，取新鲜菌液涂布于SD/-Trp(色氨酸)固体培养基上，30℃黑暗倒置培养3～4d。结果发现，诱饵表达载体可以在缺乏色氨酸的培养基上生长，表明构建的诱饵表达载体携带了色氨酸基因并且表达翻译，同时也说明诱饵表达载体已成功转入Y2HGold酵母菌株中。

图1AtCYS6基因序列克隆

图2pGBKT7-AtCYS6诱饵表达载体酶切鉴定注:M:λDNAMarker;1:重组质粒的BamHⅠ/EcoRⅠ酶切产物

1.4诱饵表达载体自激活及毒性检测

为了保证诱饵表达载体在后续文库筛选时的准确性，需要先确定诱饵表达载体有没有单独激活报告基因的能力。将构建好的诱饵表达载体转化Y2HGold酵母菌株，挑取单克隆进行培养，发现在SD/-Trp(图3A)和SD/-Trp+X-α-Gal(图3B)平板上均有酵母菌落生长，且在SD/-Trp+X-α-Gal(图3B)平板上的酵母菌落无颜色变化，在添加抗生素的培养基中无菌落生长(图3C)，表明载体无自激活能力。

为了进一步明确诱饵表达载体的表达是否会对宿主菌株产生毒害作用，本研究分别将pGBKT7空载体和构建好的诱饵表达载体转化酵母菌株Y2HGold，然后涂布于SD/-Trp平板上，30℃倒置培养2～3d，比较两个平板上菌落生长的大小和密度情况。两个平板上的菌落大小和密度相近，说明诱饵表达载体对宿主菌株没有毒性作用(图4)。

为了进一步验证构建的诱饵表达载体是否有毒性作用，本研究分别挑取pGBKT7-AtCYS6在SD/-Trp平板和SD/-Trp+X-α-Gal平板上中的单菌落接种于5mL的SD/-Trp液体培养基中，分别测量6h、12h、18h、24h、30h的OD600值，2种菌液的OD600均大于0.8且呈上升趋势(图5)，说明构建好的诱饵表达载体对宿主菌株没有毒性作用，可以用于之后互作蛋白的筛选。

图3诱饵表达载体自激活检测

2、讨论

为了进一步研究和明确真核生物的转录调控机理，人们开始应用酵母双杂交技术。该技术经历了一系列发展，包括从酵母单杂交、酵母双杂交到后来的Sos招募系统和泛素系统等，它在研究蛋白质相互作用、验证蛋白质功能、研究细胞信号转导等方面发挥着重要作用、。

图4诱饵表达载体毒性检测pGBKT7在SD/-Trp平板上的生长情况

图5诱饵表达载体菌液生长曲线

半胱氨酸蛋白酶抑制剂存在于植物体内，它可以降低或抑制蛋白酶的活力(Zhangetal.,2008;Tanetal.,2017)。研究表明，植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在非生物逆境胁迫、病虫害防御、种子萌发、程序性细胞死亡等生理过程中发挥着十分重要的作用。

在本研究中，将构建好的诱饵表达载体pGBK-T7-AtCYS6转入Y2HGold酵母菌株中，为了保证诱饵表达载体在后续文库筛选时的准确性，需要先确定诱饵表达载体有没有单独激活报告基因的能力。设计对照实验，通过在SD/-Trp、SD/-Trp+X-α-Gal和SD/-Trp+X-α-Gal+AbA等不同培养基上酵母菌落的生长情况，检测它的自激活能力。结果表明，构建的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6对报告基因没有自激活作用，另外毒性检测实验结果表明，构建的诱饵表达载体pGBKT7-AtCYS6无毒性作用。

3、材料与方法

3.1材料

质粒pGBKT7、酵母菌株Y2HGold、酵母培养基购自美国Clontech公司。DNA凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自国药集团化学试剂有限公司。BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶、环酯肽抗生素和X-α-Gal购自TaKaRa公司。

3.2AtCYS6基因的扩增及诱饵表达载体的构建

以拟南芥cDNA为模版，利用引物F:5'-GAATTCATGATGAGAAGCCGTTTCTT-3'，引物R:5'-GGATCCTGTCATGGTGTTCCGCG-3'进行PCR扩增。回收目的片段与载体pGBKT7连接，用BamHⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定并测序。

3.3诱饵表达载体转化Y2HGold酵母菌株

采用醋酸锂法制备Y2HGold酵母感受态细胞，参照徐萍萍等(2018)的方法进行诱饵表达载体酵母转化实验。

3.4诱饵表达载体自激活检测

将诱饵表达载体转化Y2HGold菌株，参照董燕梅等(2018)的方法确定诱饵载体是否对报告基因有自激活作用。

3.5诱饵表达载体毒性检测

将诱饵表达载体和空载体分别转化酵母菌株Y2HGold，然后涂布于SD/-Trp培养基上，30℃黑暗培养2～3d，观察培养基上酵母菌落生长情况。同时挑取大小一致且生长良好的单菌落于SD/-Trp液体培养基中30℃振荡培养30h，分别在6h、12h、18h、24h和30h五个时间段测定酵母菌液的OD600值，检测诱饵表达载体是否对宿主菌株有毒性作用。

参考文献:

[1]马冬梅,白俊杰,劳海华,简清,叶星,罗建仁,2003,中华鲟半胱氨酸蛋白酶抑制剂C基因的原核表达,水产学报,27(3):239-244.

郭坤元,张欣欣,林先明.拟南芥AtCYS6基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定[J].分子植物育种,2020,18(10):3246-3250.

基金:国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-21);恩施州科技计划研究与开发项目(D20180016);湖北省技术创新专项(鄂西民族专项2019AKB092)共同资助.