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探析星豹蛛细胞色素CYP3001U15基因克隆技术和生物信息学

2020-06-16 204 上传者：管理员

摘要：星豹蛛是农业害虫的重要捕食性天敌。通过转录组测序鉴定出66条星豹蛛细胞色素P450基因，进一步筛选分析出5条基因，预测其与外源物质代谢有关。为进一步研究星豹蛛细胞色素P450功能和代谢机制，选取其中一条基因进行生物信息学研究。试验通过RT-PCR扩增技术，将星豹蛛总RNA反转录cDNA，后以此为模板进行PCR扩增，回收纯化产物完成单克隆并测序，获取该基因序列信息，并对其进行生物信息学分析。结果发现，克隆到CYP3001U15基因ORF序列，该基因开放阅读框为1074bp，编码357个氨基酸，分子质量为42ku，等电点为5.91，原子总数为5808，分子式为C1877H2896N494O531S10；正电荷残基47个，占氨基酸总数的13.2%，负电荷残基52个，占氨基酸总数的14.6%；蛋白的二级结构预测结果显示，α螺旋占47.62%，β折叠占8.96%，β转角占4.76%，无规则卷曲占38.66%；亚细胞定位预测结果显示，其定位在细胞内质网上；蛋白信号肽预测结果显示，该蛋白不存在信号肽；跨膜结构预测分析结果显示，其不存在跨膜结构。研究结果可就星豹蛛细胞色素P450基因对杀虫剂等外源物代谢的研究提供理论基础。

关键词：
分子生物学
基因克隆
星豹蛛
理论基础
生物信息学分析
细胞色素P450
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蛛形纲是农田生态系统的重要组成部分，除了少数蜱螨亚纲等是重要的田间害虫外，其余多为捕食性蜘蛛，其中，星豹蛛属狼蛛科（Lycosidae）豹蛛属（Pardosa），在我国广泛分布，是一种捕食游猎型蜘蛛[1,2,3]，具有食量大、耐饥饿、习性凶猛等特点，可以捕食蚜虫、玉米螟、棉铃虫、黏虫等农业害虫，是一种重要的田间捕食性天敌优势种[4,5]。

细胞色素P450酶，又称为多功能血红素氧化酶、微粒体氧化酶等，具有上亿年的历史，是一个由结构和功能相关的基因超家族编码的同工酶所组成的超家族酶系[6,7]，该酶系通过单加氧作用使代谢废物或外源物失活，在波长450nm处有最大吸收峰值，其名称由此而来[8,9]。其对杀虫剂和环境有害化学物质等外源物均具有解毒代谢作用，其含量和活性能被有关药物或杀虫剂诱导，从而增加。在昆虫和蜘蛛等节肢动物的抗药性研究中，细胞色素P450是代谢抗性的第一道屏障[10,11]，对蜕皮激素、保幼激素和信息素等内源物及合成代谢和杀虫剂等外源物的解毒代谢具有重要作用[12,13]，是抗药性的重要生化机制之一。而目前在实际农业生产中仍以喷施化学杀虫剂为主要手段，不仅对害虫产生了“3R”效应，也对天敌蜘蛛造成了生存威胁。细胞色素P450在昆虫领域已有大量研究，但在天敌蜘蛛方面还未见报道。

山西农业大学有害生物生态防控课题组通过转录组测序鉴定出星豹蛛66条细胞色素P450基因，进一步筛选分析后预测其中5条基因与杀虫剂代谢有关。在此基础上，本试验选取其中一条基因（在转录组测序结果中编号为Unigene6361），利用RT-PCR技术克隆得到星豹蛛CYP3001U15基因，并通过生物信息学方法对该基因序列进行分析，以期对星豹蛛细胞色素P450代谢杀虫剂等外源次生物质的研究提供理论依据。

1、材料和方法

1.1试验材料

星豹蛛采自山西农业大学农作站（37°26′N,111°32′E）。将星豹蛛置于小试管中单头饲养，并在管内放置湿棉球保湿，培养环境为人工气候箱（T=(29±1）℃，RH=50%±5%,L∶D=16∶9，上海一恒仪器有限公司），以果蝇作为主要食物，每次饲喂5头果蝇，每隔1d投喂一次。

果蝇来自于室外水果诱集，以玉米粉培养基培养，培养基配方（单份）为：琼脂1.4g，白糖10g，玉米粉14g，蒸馏水120mL，丙酸（AR)0.8mL。

1.2主要试剂

BIOZOL总RNA提取试剂（杭州博日科技有限公司）；反转录试剂盒、2×TaqPCRMasterMix、胶回收纯化试剂盒和pGM-Simple-TFastCloning试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。

1.3试验方法

1.3.1星豹蛛总RNA的提取及cDNA的合成

星豹蛛总RNA的提取方法参考BIOZOL试剂说明书进行，经超微量核酸蛋白测定仪（Scandrop200，德国）检测；cDNA的合成参考试剂盒说明书进行，-20℃保存备用。

1.3.2CYP3001U15基因克隆

以合成的星豹蛛cDNA为模板，通过设计引物F:5′-TCATTCCCTCAGAGATATGG-3′；R:5′-TTGGTGTCACATAAATCAGC-3′，经RT-PCR扩增星豹蛛CYP3001U15序列。PCR反应程序为：94℃预变性3min;94℃变性30s,53℃退火30s,72℃延伸80s,30个循环；72℃延伸5min。反应总体系为25μL，包括cDNA1μL，引物F1μL，引物R1μL,2×TaqPCRMasterMix12.5μL,ddH2O9.5μL。扩增产物经电泳检测并回收纯化后连接到pGM-Simple-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，涂布至含有Amp抗性的LB平板培养基，37℃培养过夜；次日筛选单克隆菌，经菌液PCR验证后以50%甘油冻存，交由上海生工进行测序。

1.3.3CYP3001U15基因及其编码产物的生物信息学分析

使用DNAMAN9.0软件进行序列拼接，用NCBIORFfinder查找并翻译基因开放阅读框。使用Genedoc进行多序列对比；利用ExPasy-ProtParamtool分析蛋白基本理化性质；使用SingalP3.0软件分析蛋白信号肽，使用TMHMM工具预测蛋白跨膜区；利用Cell-Ploc2.0软件进行亚细胞定位预测；使用SOPMA软件预测蛋白二级结构；使用SWISSMODEL软件预测蛋白三级结构；使用MEGA7.0软件构建系统发育树。

2、结果与分析

2.1CYP3001U15基因克隆

提取的星豹蛛总RNA经超微量核酸蛋白检测仪检测，质量浓度为800ng/μL,OD260/OD280值为1.93，可以用于下一步试验。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测（图1），测序结果经ORFFinder查找发现，基因CYP3001U15开放阅读框1074bp，编码357个氨基酸（图2）。利用BlastP工具搜索同源序列并用Genedoc软件进行多重比较，结果发现（图3），星豹蛛CYP3001U15与其他蛛形纲物种的氨基酸序列比对覆盖率均达到99%以上，而序列一致性比对发现，与大腹园蛛（Araneusventricosus,GBM07777.1）和温室拟肥腹蛛的序列一致性最高，均为55%；与金丝蛛、隆头蛛和肩突硬蜱物种的序列一致性分别为53%、52%和38%，蛋白序列特征基序如图3所示。

2.2CYP3001U15编码的蛋白理化性质分析

利用ProtParam软件预测分析结果显示，CYP3001U15编码357个氨基酸，预计其在大肠杆菌体内的半衰期大于10h，在哺乳动物的网状红细胞中和酵母中的半衰期分别为30、20h；原子总数为5808，推导的分子式为C1877H2896N494O531S10，分子质量为42ku，正电荷残基为47个，负电荷残基为52个，不稳定系数47.85，为不稳定蛋白；脂肪系数为85.69，总平均亲水系数为-0.388，说明其亲水性较差，脂溶性良好，属于脂溶性蛋白。编码的总氨基酸序列中，Leu（异亮氨酸）占比最高，为9.2%；其次为Glu（谷氨酸），占比8.1%;Cys（半胱氨酸）含量最低，为0.8%。

2.3CYP3001U15跨膜预测、信号肽和亚细胞定位分析

使用TMHMM工具进行跨膜预测分析，结果显示，CYP3001U15编码产物不存在跨膜结构；使用SignalP3.0软件预测CYP3001U15编码产物的信号肽，结果显示，其不存在信号肽；使用Cell-Ploc2.0软件进行亚细胞定位预测，结果显示，其定位在细胞内质网上。

2.4CYP3001U15编码的蛋白二级结构预测分析

利用SOPMA工具预测CYP3001U15编码的蛋白二级结构，结果显示（图4),CYP3001U15编码的蛋白二级结构中，α螺旋占比最多，为47.62%；无规则卷曲占38.66%；β折叠占8.96%；β转角占比最少，为4.76%。

2.5CYP3001U15编码的蛋白三级结构预测

采用SWISSMODEL工具在线预测CYP3001U15编码产物的三级结构，结果显示（图5），建模模板为CYP4503R1(No:3c6g.2.A），在4—356位置建模，序列相似度为37%，模型覆盖率达到97%。

2.6CYP3001U15基因编码蛋白与其他蛛形纲物种系统发育树分析

利用在线BlastP在数据库中寻找与CYP3001U15基因编码蛋白同源的细胞色素P450蛋白序列，选取大腹园蛛、隆头蛛、温室拟肥腹蛛、金丝蛛、肩突硬蜱、狄斯瓦螨、染色大绒螨、梅氏热厉螨、二斑叶螨和桑红叶螨，并使用MEGA7.0软件进行聚类分析，结果显示（图6），星豹蛛CYP3001U15基因编码产物与大腹园蛛和温室拟肥腹蛛聚于同一个分支，亲缘关系最近；其次与隆头蛛和金丝蛛亲缘关系较近；与染色大绒螨、二斑叶螨和桑红叶螨亲缘关系最远。

3、结论与讨论

本研究利用RT-PCR手段从星豹蛛中克隆获得一条包含完整开放阅读框的细胞色素P450基因，其编码的氨基酸序列和蛛形纲其他物种都包含有细胞色素P450典型的“EXXR”(X代表任意密码子）保守特征基序，该特征基序属于K螺旋保守区，其中，残基“E”和“R”在所有细胞色素P450中非常保守，血红素结合区“FXXGXXXCXG”在CYP3001U15基因中为“FSVGKRSCPG”，螺旋I区的“A/GGXD/ETT/S”保守序列在星豹蛛中保守为“AGSDTVRQS”，该保守序列在不同物种中存在较大差异，如在飞蝗细胞色素P450中高度保守为“AGFETS”[14]，说明不同物种的细胞色素P450基因存在差异，导致编码产物出现差异性，所以细胞色素P450介导的抗药性出现差异性。CYP3001U15基因经国际CYP450命名委员会命名，确认其属于CYP3家族，该家族是整个细胞色素P450酶系最大的一个家族，对于昆虫细胞色素P450而言，CYP6、CYP9、CYP28、CYP300和CYP400（如CYP408、CYP413）等众多家族成员都属于CYP3家族[15,16,17]，其中，哺乳动物的CYP3家族有代谢药物的功能；而昆虫等节肢动物的CYP6和CYP9等家族已被证实与代谢植物次生物和外源物有关[18,19]。有研究发现，果蝇抗DDT品系的CYP6A2蛋白含量较敏感品系高，达40倍[20]。

目前，普遍认为细胞色素P450介导的抗药性是通过解毒酶基因的扩增和大量表达导致酶活性的升高[21]，以及多条P450基因共同作用下的结果，如棉铃虫（Helicoverpaarmigera）抗氰戊菊酯品系中发现一种嵌合体，可以使CYP337B1和CYP337B2相互交换改变，即2条基因作用下导致棉铃虫对氰戊菊酯抗性提高[22]。细胞色素P450是生物体内重要的代谢酶类，仍需进行有效的多种试验并进行技术手段的创新，更全面地认识细胞色素P450的功能和作用。

本试验以捕食性天敌蜘蛛星豹蛛为研究对象，通过克隆星豹蛛CYP3001U15基因，并对其进行生物信息学分析，研究结果对星豹蛛代谢外源物及后续深入研究该基因星豹蛛体内解毒代谢能力提供了一定理论基础，也对天敌蜘蛛绿色防控策略提供了参考。

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