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探究生防细菌ML-3抗菌蛋白稳定性

2020-06-19 286 上传者：管理员

摘要：为确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性，本研究采用不同温度、pH、紫外光照时间、金属离子、蛋白酶处理，对ML-3抗菌蛋白抑菌性进行研究。结果表明:该抗菌蛋白在低于60℃、pH5～8、紫外光照24h下可以保持较高抑菌活性;对Cu2+和Mg2+敏感，对Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，对蛋白酶K不敏感。提示ML-3抗菌蛋白在田间生物防治中具有一定应用潜力。

关键词：
ML-3
pH
抗菌蛋白
温度
紫外光照
蛋白酶
金属离子
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细菌侵染类型的病害具有种类多、分布广、危害重的特点，严重制约了农业发展。马铃薯早疫病是制约马铃薯正常发育的真菌病害之一，其是由链格孢属的茄链格孢菌引起，主要发生在植株的叶部和块茎，危害性仅次于晚疫病[1]。这种病害高发于马铃薯主要种植区，严重影响生产，降低马铃薯的产量和质量，还有可能导致大范围内病害流行。目前农业上主要采用化学农药来防治菌物病害[2]。但是，这种以化学性农药为主的密集型杀害方法，不仅会使病害对药剂产生抗药性，还会破坏农业生态系统，对人类健康造成影响[3]，采用生物防治的方法来减少化学农药的投入是发展的趋势。

山西省农科院生物技术中心曾从马铃薯茎部分离筛选出了1株马铃薯早疫病拮抗菌株ML-3。本研究旨在确定ML-3表达的抗菌蛋白在不同外部环境下的稳定性，评价该抗菌蛋白在田间的适用可能性，进而为开发抗马铃薯早疫病的生物农药提供思路，为生物防治作物病害方面的应用奠定一定基础。

1、实验材料与方法

1.1实验菌株及培养基

1.1.1实验菌株

ML-3拮抗菌株和马铃薯早疫病病原菌，由山西农业科学研究院保存和提供。

1.1.2供试细菌培养基质

参照高振峰[4]的方法配制培养基。

表1细菌培养基质配方

1.2实验方法

1.2.1菌株ML-3的活化

菌株ML-3(-80℃冰箱冻存)解冻后，取50μL悬浮液，用接种环接种到新鲜配制的NA平板上，于30℃下恒温培养48h。

1.2.2马铃薯早疫病病原菌活化

用接种环少量挑取马铃薯早疫病病原菌，接种到新配制的PDA平板上，于30℃下温箱恒温培养3d;待菌落直径长到约1.5cm左右时，挑取菌丝转接到新配制PDA平板上，于30℃下温箱恒温培养7d，为后续实验准备。

1.2.3菌株ML-3的发酵液制备

将活化培养48h后的菌株ML-3置于超净台内，用接种环挑取一环，接种到装有100mL新配制NB培养液的三角瓶中，于30℃下、振速180r/min培养72h后，终止发酵，得到菌株ML-3的种子发酵液。取发酵液接种到新配制NB培养液中，接种比例为1%(V/V)。于30℃下、振速180r/min培养72h后，终止发酵。于4℃下、转速10000r/min离心10min，最后将上清液通过微孔滤膜进行除菌，用于蛋白提取。

1.2.4菌株ML-3抗菌蛋白的硫酸铵盐析提取

根据吴艳[5]的方法提取抗菌蛋白，量取1000mL菌株ML-3发酵液到量杯中，冷水浴中加入饱和度为80%的硫酸铵，并保持搅拌，待固体溶解后，放置于4℃冰箱中进行沉淀。12h后，于转速10000r/min下离心10min，倒掉上清液。向沉淀物中加入10mL的Tris-HCL(0.01mol/L,pH8.4)缓冲液充分溶解。溶解后将溶解物装入透析袋中，在Tris-HCL(0.01mol/L,pH8.4)缓冲液中透析，每过4h更换1次缓冲液，透析72h。透析完成后，于真空冷冻干燥机中制成冻干蛋白粉，保存于-20℃冰箱备用。

1.2.5ML-3抗菌蛋白抑菌活性检测

根据采俊香、李月梅[6]的菌丝生长速率法测定抑菌率。配制浓度为0.1g/L的ML-3抗菌蛋白液，按照1∶9的比例(V∶V)将蛋白液和液体PDA培养基混合，注意不要产生气泡，倒入灭菌培养皿中，制备含药平板，等待凝固。在活化后的马铃薯早疫病原真菌平板上用灭菌打孔器取直径为5mm的菌饼，接种到凝固后的含药平板中心位置，将Tris-HCl(0.01mol/L,pH8.4)设置为对照物，于30℃下恒温培养3d，重复实验3次。

抑菌率计算公式:

公式

式中，D1为对照物处理病原菌菌落直径(mm),D2为抗菌蛋白处理病原菌菌落直径(mm),D3为菌饼直径(mm)。

1.2.6ML-3抗菌蛋白稳定性分析

1.2.6.1温度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液，按照温度梯度为22℃(室温)、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃在水浴锅中处理20min，冷却至室温，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.2酸碱度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液，用HCl和NaOH(C均为1mol/L)分别调整pH至4.0,5.0,6.0,7.0(原始)，8.0,9.0,10.0,11.0，室温静置30min，全部调回原始pH，以未经处理的抗菌蛋白液为对照，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.3紫外光照对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

取8个灭菌培养皿，分别加入抗菌蛋白液5mL，打开上盖，在20W紫外灯15cm处，分别照射2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h后，以日光照处理为对照，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.4金属离子对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

根据姜太玲、吴红洋、申光辉等[7]的方法，取6支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液。配制0.1mol/L的NaCl、KCl、CaCl2、FeCl3、MgCl2溶液，分别加入到装有抗菌蛋白液的离心管中，剩余1管中加入Tris-HCl缓冲液做对照，于4℃下静置6h后，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.6.5蛋白酶对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

根据杨帆、张飞燕、孙劲冲等[8]的方法，取4支10mL的灭菌离心管，分别加入5mL抗菌蛋白液。配制浓度均为1mg/mL的胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K溶液，分别加入到装有抗菌蛋白液的离心管中，剩余1管中加入去离子水做对照，37℃下水浴2h后，100℃水浴2min终止反应，进行抑菌活性测定，方法同1.2.5，重复实验3次。

1.2.7数据处理

所得数据采用Excel2010和SPSS25进行整理分析。

2、实验结果与分析

2.1温度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

ML-3抗菌蛋白在22～100℃范围内处理20min后，抑菌性发生变化(图1)。在60℃内，抑菌率与对照组相比，不存在显著差异(p>0.05)，基本能够保持在80%以上;但当处理温度>70℃时，抑菌率与对照组相比，存在显著差异(p<0.05);在70℃条件下抗菌蛋白抑菌率降低到60.2%;处理温度升高到80℃时，抑菌率降低到40.1%;当处理温度高于90℃时，抑菌活性基本消失。原因可能是抗菌蛋白在高温热处理中，具有抗菌活性的多肽中某些关键化学键发生变化，蛋白质结构也随之变化，导致该抗菌蛋白失活。

图1不同温度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

2.2酸碱度对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

ML-3抗菌蛋白在pH4～11范围内处理30min后，抑菌性发生变化(图2)。在pH6～8的范围内，抗菌蛋白的抑菌性受影响不大，抑菌率均能保持在80%左右，与对照组相比，不存在显著差异(p>0.05)，该抗菌蛋白适应弱酸和中性的环境;在pH为5的时候下降到62.4%，在pH为4和pH为9时，抑菌率显著下降到40%左右，与对照组相比，存在显著差异(p<0.05);当pH达到10以上，抗菌活性基本消失，该抗菌蛋白在过碱的环境中不稳定，不耐强碱环境。

图2不同pH环境对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

2.3紫外光照对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

ML-3抗菌蛋白在紫外光照不同时间后，抑菌性基本没有发生变化(图3)，均保持在80%左右，和对照组相比，不存在显著差异(p>0.05)，说明该抗菌蛋白具有较强的抗紫外线能力。

图3不同紫外光照时间对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

2.4金属离子对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

ML-3抗菌蛋白在不同金属离子溶液环境中处理后，抑菌活性的变化，结果如图4。其中，Na+、K+、Zn2+和Fe2+处理对抗菌蛋白抑菌活性无明显影响，与对照组相比，不存在显著差异(p>0.05)，抑菌率仍能保持80%左右;但是经Cu2+和Mg2+处理后，抗菌蛋白抑菌性基本消失。分析原因可能是抗菌蛋白和这2种金属离子发生鳌合，蛋白质三维结构发生变化，导致抑菌活性丧失。

图4不同金属离子对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

2.5蛋白酶对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

ML-3抗菌蛋白在通过3种蛋白酶酶解作用后，抑菌活性有所变化(图5)。蛋白酶K对抗菌蛋白抑菌率的影响不大，能保持在84.2%，与对照组相比，不存在显著差异(p>0.05)，说明该蛋白对蛋白酶K具有较强耐受性;胰蛋白酶和胃蛋白酶对抗菌蛋白的影响大，抗菌蛋白抑菌性显著下降，抑菌率分别为30.2%和31.4%，与对照组相比，存在显著差异(p<0.05)，该抗菌蛋白对胰蛋白酶和胃蛋白酶不耐受。

图53种蛋白酶对ML-3抗菌蛋白抑菌性的影响

3、讨论

在作物病虫害防治中利用生物农药，对保障农产品食用安全、保护农业生态环境、降低细菌抗药性等方面具有十分重要的意义。目前学者对生物农药的研究大多集中在实验室条件抑菌效果方面，对其在模拟田间条件下的稳定性研究较少。很多生物农药尤其是生防菌株，对外界环境适应性差，防治效果容易受到环境影响。本研究从马铃薯茎部分离的生防细菌ML-3的发酵液中，通过硫酸铵沉淀法提取蛋白，进行温度、pH、紫外光照、金属离子和蛋白酶解稳定性分析，得出结论:该抗菌蛋白在低于60℃、pH在5～8、紫外光照24h条件下可以保持较高抑菌活性;对Cu2+和Mg2+敏感，对Na+、K+、Zn2+和Fe2+不敏感;对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，对蛋白酶K不敏感。

ML-3抗菌蛋白具有良好的热稳定性，对酸性环境的耐受性大于碱性环境。很多生物农药对紫外线比较敏感，紫外线稳定性也是一个重要评价指标。该抗菌蛋白在紫外光照24h后下仍具有较高抑菌活性，说明其具有紫外稳定性。在实际生产过程中需要把化学农药和生物农药混合使用，实验结果提示ML-3抗菌蛋白在作为生物农药使用时，不能与含有Cu2+和Mg2+的化学农药混合使用。胰蛋白酶和胃蛋白酶是人体中帮助消化2种重要的酶，施用过生物农药的马铃薯进入人体消化系统，其携带的ML-3抗菌蛋白会被这2种酶酶解，不会被人体吸收，影响身体健康。这些结果为马铃薯早疫病拮抗菌株ML-3的生防田间应用奠定了一定基础。

参考文献：

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李静舒,赵佳.生防细菌ML-3抗菌蛋白稳定性研究[J].农业与技术,2020,40(11):23-25+35.

基金:山西省面上青年基金项目(项目编号:201701D221169).