摘要:目的 探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效,为开发高效低毒的抗菌药物奠定实验基础。方法 以MRSA(USA300)为宿主菌,从地下污水中分离筛选出1株噬菌体PhMASA-WJ,双层琼脂平板培养法测定噬菌体效价,点滴法测定噬菌体裂解谱,确定最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),提取噬菌体全基因组并进行酶切鉴定,电镜观察噬菌体形态,并检测噬菌体的体外裂解效果、安全性及其对小鼠败血症的疗效。结果 PhMASA-WJ在USA300菌苔上形成直径1~2 mm的圆形、透明且边界清晰的噬菌斑,PhMASA-WJ效价为7. 1×108 PFU/m L,其为专一裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体,最佳MOI为0. 001,属于RNA病毒,基因组大小约23 000 bp。电镜观察显示,PhMASA-WJ属于有尾噬菌体目肌尾噬菌体科。动物实验证实,PhMASA-WJ对小鼠无毒副作用,败血症小鼠经PhMASA-WJ治疗后存活率为60%,对照组全部死亡,PhMASA-WJ治疗显著提高了小鼠的存活率(P <0. 001)。结论 PhMASA-WJ有严格的宿主特异性,裂解谱窄且裂解能力强,能显著提高败血症小鼠的存活率,为临床治疗MRSA感染提供了实验依据。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌自1961年在英国首次被发现后,临床检出率逐年上升,已成为世界各地医院内感染的首要病原菌[1,2]。MRSA呈现多重耐药性,只对糖肽类抗菌药物敏感。但随着糖肽类抗菌药物的广泛使用,不同程度的耐万古霉素金黄色葡萄球菌已出现[3],成为临床治疗难点,严重影响患者的预后。由于MRSA感染率和致死率高及多重耐药等特点,使其成为全球性重要的公共卫生问题。20世纪80年代,防控MRSA感染、乙型肝炎及艾滋病三大感染性疾病已成为世界各国的难题[4]。因此,寻找新型抗菌方法治疗MRSA感染已成为研究热点,高效安全的抗菌生物制剂成为替代抗生素药物的研究方向。
噬菌体具有独特的裂解机制和严格的宿主特异性,只侵染细菌,对人和其他动植物无害,增殖速度快,研发时间短,是一种安全的治疗耐药性细菌感染的生物制剂[5,6]。近年来,一些能够裂解多种耐药菌株的裂解性噬菌体被分离,并用于多重耐药性细菌感染中,如金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌等[7,8,9]。开发高效的噬菌体抗菌制剂已成为临床控制MRSA感染性疾病研究的新思路。
本研究以MRSA(USA300)为宿主菌,从地下污水中分离得到裂解性MRSA菌株的噬菌体,分析其生物学特性、裂解效果及对败血症模型小鼠的疗效,为噬菌体制剂的开发及MRSA感染的有效防治提供参考。
1、 材料与方法
1.1菌株及样品
MRSA(USA300)、临床分离的沙门菌、大肠埃希菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯菌等细菌均由四川农业大学动物医学院鱼病研究中心保存;污水样品采集自四川成都温江某下水道。
1.2实验动物
健康SPF级BALB/c小鼠,雌性,6~8周龄,体重约20 g,购自成都达硕实验动物有限公司。动物合格证号:51203500013466,512035-00013467。
1.3主要试剂
DNA酶Ⅰ、RNA酶A和核酸内切酶HindⅢ、BamHⅠ均购自日本TaKaRa公司;LB培养基(液体、半固体和固体)按照文献[10]配制。
1.4噬菌体的分离纯化
参照文献[11]进行污水的预处理,取2 m L处理后的污水,与1 m L 3×LB培养基混合,接种100μL对数期宿主菌USA300,37℃振荡培养过夜。10 000×g离心10 min,用孔径为0.22μm的滤器过滤上清液,滤液为噬菌体原液,4℃保存。
参照文献[12]的点滴法检测噬菌体。取200μL宿主菌USA300,与5 m L约50℃的LB半固体培养基混匀,倒入底层LB固体培养基中,滴加噬菌体原液于平板上,静置晾干后,37℃恒温箱中培养过夜,观察是否出现噬菌斑。用接种环挑取单个噬菌斑,加入对数期USA300培养物中,37℃培养过夜,离心取上清液过滤。参照文献[13],采用双层琼脂平板法纯化噬菌体,重复操作5次以上,待观察到的噬菌斑形态、大小均匀一致后,获得纯化的噬菌体。
1.5噬菌体效价的测定
将纯化后的噬菌体悬液用无菌SM缓冲液连续倍比稀释9个梯度(10-1~10-9),采用双层琼脂平板培养法测定各稀释度噬菌体效价,每个稀释度重复3次。37℃培养完成后,统计噬菌斑数目,并按下式计算噬菌体滴度。
1.6噬菌体裂解谱的测定
采用点滴法测定宿主谱,测试菌株包括沙门菌、大肠埃希菌、嗜水气单胞菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯菌。
1.7噬菌体最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)的测定
按MOI分别为10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6混合噬菌体悬液和对数期USA300各100μL,各试管均加入5 m L LB液体培养基使总体积相同,37℃,180 r/min振荡培养4 h。将混合培养物离心过滤除菌,测定噬菌体效价,效价最高者的MOI为噬菌体最佳MOI。试验重复3次。
1.8噬菌体全基因组提取及酶切鉴定
取1 L对数生长期USA300菌液,加入MOI为0.001的噬菌体,37℃继续培养至USA300完全裂解,按照文献[14]方法进行噬菌体扩大繁殖浓缩及全基因组提取。提纯后的噬菌体核酸分别用DNA酶Ⅰ、RNA酶A、核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ于37℃进行酶解反应3 h,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切产物,电泳时间45 min,电压90 V。
1.9噬菌体的电镜观察
取100μL噬菌体浓缩液滴在石蜡上,将铜网置于噬菌体液上,采用磷钨酸负染法[15],用透射电镜观察并记录噬菌体形态和大小。
1.1 0噬菌体的体外裂解效果测定
按MOI为0.001混合噬菌体悬液和宿主菌USA300,加入5 mL LB液体培养基,同时设不加噬菌体的细菌对照,37℃,180 r/min培养4 h后,观察培养液的澄清度。
1.1 1噬菌体的安全性试验
取10只小鼠,经尾静脉注射噬菌体生理盐水稀释液100μL(1010 PFU/mL),每日观察小鼠进食量、活动情况、精神状态、体温和体重变化及生存情况[16]。观察10 d后,腹腔注射5%水合氯醛麻醉小鼠,用无菌手术刀剖开小鼠腹腔,观察心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏及肠道等器官的病理变化情况。
1.1 2噬菌体对败血症小鼠的疗效观察
取40只小鼠,随机分为4组:前3组经腹腔注射100μL不同浓度的USA300菌液(1010、109、108 CFU/mL),对照组注射相同剂量的生理盐水,10 d内观察各组小鼠的存活情况。致小鼠全部死亡的最低菌量为绝对致死量(LD100)[17]。
取20只小鼠,经腹腔注射LD100剂量的USA-300菌液,建立败血症感染模型[18],2 h后随机挑选10只小鼠,经尾静脉注射1010 PFU/mL噬菌体悬液100μL作为治疗组,对照组经尾静脉注射生理盐水100μL,每天观察小鼠的临床表现和存活情况,共观察10 d。
1.1 3统计学分析
使用SPSS 13.0统计软件(Inc.,Chicago,IL,USA)进行数据分析,采用Kaplan-Meier法对小鼠的生存曲线进行统计分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果
2.1噬菌体的分离纯化和裂解谱
以USA300菌株为宿主菌从污水中成功分离到1株噬菌体,命名为PhMASA-WJ。点滴法检测发现,宿主菌被侵染,可见大面积且边缘光滑、清晰透明的噬菌斑,见图1。纯化后平板上可见形状一致、大小均一的噬菌斑,见图2。噬菌斑边缘清晰,且中间透亮,无晕环,直径为1~2 mm,为裂解性噬菌体的特征。双层琼脂平板法测得该噬菌体效价为7.1×108 PFU/mL,表明PhMASA-WJ具有较强的裂解特性。裂解谱试验发现,PhMASA-WJ不能裂解被测菌株,表明其为专一裂解金黄色葡萄球菌的噬菌体。
2.2噬菌体的最佳MOI
MOI从10到0.000 001,噬菌体PhMASA-WJ效价的变化趋势为先升高后降低,当MOI为0.001时,PhMASA-WJ效价最高,达4.73×1010PFU/mL,见表1,因此PhMASA-WJ最佳MOI为0.001。
图1点滴法检测噬菌体
图2噬菌体PhMASA-WJ噬菌斑形态
表1噬菌体最佳MOI的测定
2.3噬菌体基因组及酶切产物的鉴定
1%琼脂糖凝胶电泳分析显示,提取的噬菌体PhMASA-WJ基因组浓度及纯度均较好,大小约23 000 bp;酶切分析表明,PhMASA-WJ基因组对DNA酶不敏感,对RNA酶敏感,无HindⅢ和BamHⅠ酶切位点,表明PhMASA-WJ为RNA噬菌体。见图3。
图3噬菌体PhMASA-WJ核酸类型的鉴定
2.4噬菌体的电镜观察
透射电镜观察显示,噬菌体PhMASA-WJ头部呈正多面体对称结构,尾部细长,噬菌体全长190 nm,头部直径约60 nm,尾部长约130 nm。见图4。
图4噬菌体PhMASA-WJ的透射电镜照片(×60 000)
2.5噬菌体体外裂解效果
噬菌体与宿主菌混合培养8 h后,培养液变得澄清,对照组浑浊,形成鲜明对比,见图5,可初步判定PhMASA-WJ为裂解性噬菌体。
2.6噬菌体的安全性
观察期内,10只小鼠均未出现精神不振、被毛粗乱、食欲减退、体重下降等临床症状及死亡,解剖也未发现组织脏器任何病理变化,表明噬菌体PhMASA-WJ对实验小鼠具有良好的安全性。
2.7噬菌体对败血症小鼠的疗效
小鼠腹腔注射100μL不同浓度的USA300菌液,注射菌量为109 CFU的小鼠在2 d内全部死亡,注射菌量为108和107 CFU的两组小鼠均未见死亡,因此,USA300对小鼠的LD100为109 CFU。
以109 CFU USA300攻毒2 h后,小鼠表现出蜷曲发抖、嗜睡等症状。经噬菌体PhMASA-WJ治疗后,败血症小鼠存活率为60%,存活的小鼠精神状态和食欲良好,被毛光滑,对照组小鼠2 d内全部死亡,噬箘体PhMASA-WJ能显著提高小鼠的存活率,且差异有统计学意义(P<0.001),见图6。
图5噬菌体PhMASA-WJ体外裂解效果观察
图6噬菌体PhMASA-WJ治疗败血症小鼠的生存曲线
3、 讨论
MRSA是医院感染的主要病原菌之一[19,20],由于其对多种药物产生耐药性,国外许多医院对MRSA的监测与防控予以高度重视[21]。噬菌体是一种能特异性识别并感染裂解细菌的病毒,毒副作用小,且具有指数增殖能力,理论上使用噬菌体治疗只需一次给药。噬菌体只在细菌感染部位发挥作用,对宿主菌产生严格依赖性,随其清除而死亡,无残留[22],因此,噬箘体治疗被认为是对抗人类致病菌(包括耐药菌株)最有希望的疗法之一。前苏联和东欧一些地区在20世纪20年代尝试使用噬菌体疗法治疗各种耐药性病原菌引起的伤口感染、呼吸道感染、肠道感染、腹膜炎和菌血症,结果证实,噬菌体能高效治疗由耐药细菌引起的疾病[23]。金黄色葡萄球菌噬菌体治疗在动物实验中显示出极好的疗效,少数临床病例报道也证实了其可行性和安全性。
本研究从下水道污水中成功分离到1株MRSA裂解性噬菌体PhMASA-WJ,并对其生物学特性及其对小鼠败血症的疗效进行了分析,结果表明,PhM-ASA-WJ可在其USA300菌苔上形成边缘清晰、透明的噬菌斑,噬菌斑中间透亮,无晕环,直径为1~2 mm,为裂解性噬菌体的特征[24]。纯化后PhMASA-WJ的效价大于108 PFU/mL。基因组提取和酶切鉴定表明,PhMASA-WJ为RNA噬菌体。根据2012年国际病毒分类委员会(ICTV)第9次报告提出的噬菌体分类与命名标准[25],按照透射电镜观察结果,推测PhMASA-WJ属于有尾病毒目肌尾噬菌体科,与鞠磊等[26]分离的噬菌体qdsa002形态一致。PhMASA-WJ在USA300宿主菌上的最佳MOI为0.001,曾志良等[27]和李陇平等[28]分离得到的金黄色葡萄球菌噬菌体最佳MOI均为0.01,与之相比,PhMASA-WJ的裂解能力更强。该最佳MOI的确定有利于快速收获高滴度噬菌体悬液,为将来治疗研究时噬菌体的大量制备奠定了基础。
宿主谱测定表明,PhMASA-WJ是一株专一性很强的噬菌体,只裂解USA300,对沙门菌、大肠埃希菌、嗜水气单胞菌及无乳链球菌等临床分离菌株均无裂解作用。体外裂解试验证明,加入噬菌体后,菌液变澄清,表明PhMASA-WJ的裂解能力强,潜伏时间短、裂解量大的噬菌体在临床治疗上有广阔的应用前景。虽然噬菌体裂解细菌具有专一性,但可筛选宽噬菌谱的噬菌体技术以及采用多种噬菌体混合的“鸡尾酒”噬菌体制剂来治疗多种菌株的感染,这也是未来噬菌体应用的一种趋势[29]。
在安全性方面,经尾静脉注射大剂量PhMASA-WJ小鼠未出现精神不振、被毛粗乱、食欲减退、体重下降及死亡等表现,剖检发现,所有组织脏器无任何病理变化。经噬菌体治疗后,小鼠存活率达60%,且未出现因细菌快速裂解而导致的各种毒副反应(如发热、休克等),小鼠生存试验也进一步证明,PhMASA-WJ对USA300导致的败血症具有很好的治疗效果,明显提高了小鼠存活率。
综上所述,本研究筛选的噬菌体PhMASA-WJ具有较好的生物学特性,裂解效率高,无毒副作用,能明显提高由USA300感染引起的败血症小鼠的存活率,表明噬菌体PhMASA-WJ作为一种安全、有效的生物抗菌剂具有广阔的开发应用前景,为防治MRSA感染、开发噬菌体生物制剂提供了一种新的思路。
参考文献:
[1]王俊瑞,向茜,尚欣荣,等.定植压力与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌医院内交叉传播相关性研究[J].中华检验医学杂志,2010,33(10):936-941.
[4]杨长顺,刘文恩.MRSA耐药机制与分子生物学检测方法研究新进展[J].中华医院感染学杂志,2007,17(3):356-358.
[5]李萌,韩峰,林洪,等.一株沙门氏菌烈性噬菌体的分离纯化与生理特性研究[J].水产科学,2013,9:531-535.
[6]唐陶,陈冰冰,龙航宇,等.噬菌体对细菌感染的治疗作用及应用研究[J].中国兽医杂志,2018,54(03):50-53.
[8]付丽娜,王丽丽,李晓宇,等.噬菌体对三大耐药菌的防控作用研究进展[J].中国抗生素杂志,2017,42(10):836-841.
[9]高静,刘新.噬菌体治疗细菌性感染的研究进展[J].国际检验医学杂志,2016,37(23):3325-3327.
[10]萨姆布鲁克J,拉塞尔DW.分子克隆实验指南[M].3版.黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等.译.北京:科学出版社,2002:1595-1604.
[11]范锦戴,申晓晨,马若瑶,等.一株奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性的研究[J].中国兽医科学,2015,45(12):1236-1241.
[12]柏琴琴.无乳链球菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性和比较基因组学分析[D].南京:南京农业大学,2013.
[13]范锦戴.一株可裂解大肠杆菌和沙门氏菌的噬菌体基因组学分析及其裂解酶活性鉴定[D].广东广州:华南农业大学,2016.
[15]安慧婷.单增李斯特菌溶源性噬菌体的分离鉴定及部分基因功能研究[D].上海:上海交通大学,2014.
[16]靳静,陈松建,张改,等.克雷伯菌属噬菌体LH-01的生物学特性及其对败血症小鼠疗效的初步研究[J].中国病原生物学杂志,2015,10(1):25-28,33.
[17]赵影,刘秀侠,李金敏,等.一株鼠伤寒沙门氏菌噬菌体的分离鉴定及对小鼠的防制效果研究[J].中国畜牧兽医,2018,45(1):234-241.
[18]李振江,黄德海,靳静,等.肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体PhF168的生物学特性及其对重症败血症小鼠疗效的初步研究[J].中国病原生物学杂志,2016,11(6):495-499.
[21]周宏.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的调查及药物敏感性试验[J].广州医药,1997(2):63.
[22]汤芳,陆承平.猪链球菌的烈性噬菌体和前噬菌体[J].微生物学报,2015,55(4):389-394.
[25]冯烨,刘军,孙洋,等.噬菌体最新分类与命名[J].中国兽医学报,2013,33(12):1954-1958.
[26]鞠磊,王静雪,林洪,等.一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa002的分离鉴定及其生理学性质研究[J].食品工业科技,2016,37(16):230-233.
[27]曾志良,伍绮文,赵晓亚,等.一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离及其裂解酶的原核表达[C].北京:中国畜牧兽医学会动物微生态学分会,2014:1.
[28]李陇平,张智英.金黄色葡萄球菌烈性噬菌体的分离鉴定和最佳保存方法研究[J].中国畜牧兽医,2011,38(6):141-146.
涂尊方,税斐,何汶璐,廖娅欣,缪玉佳,邓益,汪开毓,耿毅,欧阳萍.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌裂
解性噬菌体PhMASA-WJ的生物学特性及其对小鼠败血症的疗效[J].中国生物制品学杂志,2020,33(05):521-526.
基金:四川农业大学创新创业训练计划项目(201710626021);质量工程创新创业训练计划项目(201710626021).
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