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探究石斑鱼病毒性神经坏死病表现和防治技术

2020-05-23 370 上传者：管理员

摘要：主要综述了病毒性神经坏死病的基本特征、诊断技术等研究进展,介绍了神经坏死病毒的防控技术及策略,简单概述了在石斑鱼养殖过程中病毒性神经坏死病的防控工作。

关键词：
暖水性礁栖鱼类
病毒性神经坏死
石斑鱼
防治技术
食用鱼
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1、我国石斑鱼养殖和神经坏死病发病现状

石斑鱼(Epinephelussp.)是鲈形目(Perciformes)、石斑鱼属(Epinephelus)鱼类的总称,为暖水性礁栖鱼类。石斑鱼体色色彩斑斓艳丽,肉质鲜美,营养全面均衡,同时鱼肉低脂肪、高蛋白,是不可多得的上等食用鱼。

我国人工养殖石斑鱼始于1980年[1],目前石斑鱼养殖地区主要在沿海省份中的广东、广西、福建、浙江、海南五个省。随着时间的推移,在石斑鱼养殖过程中发现病毒性神经坏死病危害严重,最严重时可导致养殖鱼苗在一周内全部死亡。

鱼类病毒性神经坏死病是由于神经坏死病毒(Nervousnecrosisvirus,NNV)入侵鱼体,导致石斑鱼脑、视网膜、鱼中枢神经等神经系统坏死的病毒,由该病毒引起的石斑鱼病毒性神经坏死病主要发生在石斑鱼的稚鱼期和幼鱼期。

2、神经坏死病毒

神经坏死病毒( Nervous necrosis virus,NNV)是β诺达病毒属(Betanodavirus)的一种[2]。于1997年,Nishizawa 等人对25种Betanodavirus病毒外壳蛋白基因所包含的部分核苷酸序列的同源性进行分析比对,最终将其分为4种血清型,即tiger puffer nervous necrosis virus(TPNNV)、striped jack nervous necrosis virus(SJNNV)、red-spotted grouper nervous necrosis virus(RGNNV)和barfin flounder nervous necrosis virus(BFNNV)[3,4]。

3、检测、诊断技术

3.1表型观察

石斑鱼患该病毒症后主要表现症状为身体发黑、腹部肿胀向上漂浮在水面、在水面狂游或呈螺旋状游泳、厌食甚至停食、死亡。解剖病鱼,发现处于发病初期的鱼脾脏鲜红,随病情加重逐渐肿大、发黑或呈暗红色。病鱼肝脏呈土黄色或萎缩状,鱼鳔有胀气现象,病鱼脑组织颜色有变红现象,病鱼的肾脏器官坏死、糜烂。鱼体头大而身小、形体消瘦[1]。

3.2免疫学诊断技术

利用免疫学的技术方法可以比较快速地进行诊断,如酶联免疫吸附测定试验(ELISA)可以利用具有专一性的抗原和抗体进行检测,可以检测到病鱼组织内存在的少量或微量抗原,灵敏度较高,但是由于某些外在因素影响往往导致ELISA的特异性结合不稳定容易呈现出假阳性结果。目前在NNV的检测领域中虽然已经被应用,但是在逐步地被分子生物学的检测方法取代。如Watanabe等人通过该方法对条斑星鲽亲鱼进行检测,结果表明当ELISA的抗体检测不超过40滴度时,利用该方法筛选出没有携带病毒粒子的健康亲鱼,利用经过筛选的条斑星鲽亲鱼进行繁殖,其产生的后代仔鱼基本不发病[5]。

3.3分子生物学检测技术

利用分子生物学技术进行检测特别是PCR法可以有效、便捷地检测到病毒是否存在。随着研究层次的逐渐深入,生物技术的不断提高,已经衍生出多种多样的PCR检测方法。刘荭等设计出四种引物采用RT-PCR的检测方法来鉴别出四种基因型各不相同的神经坏死病毒[6];陈信忠等利用RT-PCR检测技术成功地在5种养殖的石斑鱼中扩增出NNVRNA2条带[7];Mu等在25%～40%的健康斜带石斑幼鱼中检测到了NNV粒子[8];陈晓燕等利用PCR技术对斜带石斑鱼神经坏死病毒粒子的外壳蛋白基因进行克隆和序列分析,证明了该病毒株是RGNNV血清型的成员[9]。利用PCR技术检测时可以极大地缩短技术人员的操作时间,操作简单便捷,并且所得结果基本有效。其中LAMP检测方法,可以使操作过程不需要某些特定设备且时间在1～2h内,目前这种技术已经被普遍应用在病毒检疫防控领域[10]。

细胞培养技术也是诊断石斑鱼患病情况的技术之一,它利用对病毒比较敏感的某些细胞系或者细胞株进行人工培养,而后进行鉴定、分离以及确诊。使用电子显微镜观察切片时找到与病鱼组织中含有的相同的病毒颗粒,再将利用细胞培养技术培养出来的病毒颗粒对健康鱼个体进行回接,感染后出现相同症状。如林楠等利用细胞培养技术对福建漳州市石斑鱼鱼苗进行病原的分离与鉴定[11];蒋方军等利用细胞系培养进行鱼类神经坏死病毒的分离[12]。但是细胞培养技术难度大、耗时长,不适合养殖基地现场检测,但却是细胞学、免疫学等领域非常重要的技术手段。

4、病毒传播途径

神经坏死病毒的传播途径可以分为两种:第一种是通过亲鱼传向仔鱼的垂直传播。第二种是通过水体、饵料、水草等养殖环境的水平传播[2,3]。

垂直传播是由携带该病毒的石斑鱼产卵,此时卵中带有神经坏死病毒粒子,待卵孵化为仔鱼时爆发病毒性神经坏死病。筛选不携带病毒的健康鱼体是切断垂直传播的主要途径,Watanabe等利用PCR技术同时结合ELISA技术,对石斑鱼亲鱼中是否含有该病毒粒子进行检测,然后将筛选得到的不携带病毒粒子的亲鱼繁殖,获得不携带病毒的鱼卵,发现亲鱼所产生的后代仔鱼不容易患有病毒性神经坏死病。因此他们认为,筛选出健康不携带病毒粒子的亲鱼是切断垂直传播的有效手段[5]。

水平传播是由于在养殖水体中有病毒粒子的存在或鱼苗中有携带病毒粒子的个体,它们释放病毒粒子附着在水中、饵料上、水草上或直接接触其他个体从而传播疾病。Gomez等分离出饵料杂鱼中所携带的NNV病毒粒子,利用健康的七带石斑鱼(E.septemfasciatus)对细胞培养出的NNV粒子进行回接感染试验,在两周后,发现健康石斑鱼的鱼脑及鱼神经中出现了同样的病毒颗粒,并且造成该批试验用鱼90%以上的死亡率,说明了在饵料杂鱼中含有的病毒是可以感染健康鱼体的[13];Manin等把两种鱼的幼鱼浸泡在病鱼的匀浆液中,之后对全部的幼鱼进行检测,结果发现全部个体都含有NNV,表明NNV可以利用水平传播为其传播途径[14]。所以在养殖中需要及时对养殖水体进行消毒,减少密度,注意水体变化。

5、防治途径

5.1物理防控

目前关于神经坏死病的防治报道比较少,能够有效抑制病毒扩散,提高鱼苗成活率的方法不多。主要需警惕该病毒的垂直传播,应选择健康无病亲鱼的后代;及时清理鱼塘中的垃圾、残饵;定时投喂益生菌等加强鱼类免疫力;适当降低养殖密度。

5.2免疫防控

疫苗免疫是目前最重要、最有效的免疫手段之一。且在海水鱼病毒性疾病研究中已经有比较多的成果。比如在赤点石斑鱼仔鱼、幼鱼中通过注射疫苗的方式证明,注射NNV疫苗可以使幼鱼成活率提高约67%[15,16]。

朱建蕊等利用大肠杆菌表达NNV的衣壳蛋白,投喂黄粉虫,并利用黄粉虫喂养石斑鱼从而提高了石斑鱼感染NNV后的成活率[17];Lu等利用转化后的大肠杆菌表达NNV外壳蛋白从而获得类病毒颗粒,产生的该种病毒颗粒能在鱼类神经表面与NNV病毒粒子争抢结合点,这样就极大地抑制了病毒侵入石斑鱼神经细胞,使病毒入侵细胞的效率大大降低,对宿主起到了很好的保护作用[18];Sommerset等将病毒外壳蛋白重组进行免疫,发现当使用量为10μg时重组蛋白具有较好免疫保护效果[19]。

然而在实际养殖过程中处于病毒性神经坏死病爆发期的仔鱼、幼鱼的特异性免疫系统还没有发育或还没有发育成熟,并不能起到特异性免疫的效果。所以关于如何有效使海水鱼类产生免疫保护的防治技术仍需要深入研究。

6、展望

自我国海水鱼养殖业兴起后,病害问题一直危害着产业的发展,并且带来巨大损失。NNV对石斑鱼乃至海水鱼的鱼苗培育有着巨大的威胁,如何解决NNV,如何防控疾病是我国养殖业发展迫在眉睫、不可回避的重要课题。加强免疫检测,筛选不携带病毒粒子的健康亲鱼,注意水体健康,切断病毒的垂直传播并有效抑制病毒的水平传播才能更好地防控疾病。

参考文献:

[1]赵平平.石斑鱼病毒性神经性坏死病研究现状[J].黑龙江水产,2011(05):44-46.

[3]陈信忠.石斑鱼病毒性神经坏死病研究[D].厦门大学,2006.

[6]刘荭,史秀杰,高隆英,等.鱼病毒性神经坏死病病毒(VNNV)不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用[J].水产学报,2004(06):695-702.

[7]陈信忠,苏亚玲,龚艳清,等.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测5种养殖石斑鱼的神经坏死病毒[J].中国水产科学,2004(03):202-207.

[9]陈晓艳,黄剑南,吕玲,等.斜带石斑神经坏死病毒外壳蛋白基因克隆与序列分析[J].水产学报,2004(02):183-188.

[10]黄文,陈偿,赵哲,等.海水养殖鱼类病毒性神经坏死病防控技术研究进展[J].渔业研究,2016,38(05):419-426.

[11]林楠,吴斌,李苗苗,等.石斑鱼病毒性神经坏死病的病原分离和鉴定[J].福建农林大学学报(自然科学版),2019,48(04):474-479.

[12]蒋方军.鱼类神经坏死病毒的分离和部分特性研究[D].华中农业大学,2008.

[17]朱建蕊,翟伟锋.NNV衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其应用[J].南方农业,2018,12(06):112-114.

魏盟智,李亚军,安鑫龙,邓晓东.石斑鱼病毒性神经坏死病防治的研究现状[J].河北渔业,2020(05):51-53.

基金:国家自然科学基金项目(31870344);农业农村部财政专项(NFZX2018);中国热带农业科学院基本科研业务费专项资金(NO.19CXTD-32).