随着我国栽培技术的成熟,农用地膜的使用量逐年攀升[1],地膜难降解、回收难等问题日益凸显,因此可生物降解地膜得到了广泛研究关注.可生物降解地膜在田间铺设的过程中,随着植物的生长发育,地膜开始发生降解过程.一方面,自然环境中的水分可以使地膜进行水解过程,另一方面由于土壤中存在多种多样的微生物,而微生物产生的蛋白酶使地膜可以进行酶解过程[2].但是降解产物在土壤环境中积累到一定程度后,容易被植物根系吸收,进而被运输到植物的地上部分,直接影响植物的养分和水分吸收能力,甚至影响植物的生长发育[3].

脂肪族聚酯类的地膜如聚己二酸丁二醇酯(PBS)、聚乳酸(PLA)等由于其热塑性良好、生物降解性优异等特点而备受青睐[4].张敏等[5]通过PBS对植物生理特性的研究发现,低质量分数的PBS对青菜、生菜的生长发育具有促进作用.张敏等[6]又通过PBS/PLA共聚物对青菜生长发育的研究发现,PBS/PLA共聚物能够提高植物的过氧化物酶活性增强其抗逆性.

聚丁二酸己二酸丁二醇酯(PBSA)是一种生产成本低、力学性能好、加工性能优异,在土壤环境中可以进行自然降解以及微生物降解过程[7],且降解产物对环境无污染的绿色材料[8].Motoo等[9]通过研究从大麦叶片分离得到的B47-9型菌株在土壤环境中对PBSA膜的降解发现,6天内降解率可达91.2%.Katerina等[10]通过研究含有不同浓度PBSA的水体对虹鳟的毒性实验发现,PBSA能够进入虹鳟体内并对其细胞色素、血液指标及酶活性产生影响.Wang等[11]通过研究PBSA膜在棉花种植过程中的变化发现,PBSA膜能够在作物种植过程中有效降解,缓解残留地膜对土壤环境的威害.

但是,国内有关其作为可生物降解地膜时对植物生长发育的影响少有报道.因此,本研究通过PBSA的降解产物分析以及植物盆栽实验,探究了PBSA在其降解过程中对青菜种子发芽及生长周期生理生化指标的影响,综合评价了PBSA作为地膜成分时对青菜的生态学效应,并为PBSA作为地膜材料的安全推广及应用提供了理论依据.

1、材料与方法

1.1材料及培养

实验中所用到的PBSA均由实验室合成.植物种子选用矮抗青,购自上海市闵行区种子公司,实验前用10%次氯酸钠进行消毒,并用去离子水进行冲洗.种子发芽实验取样时间为7d,生长周期实验取样时间为0d、11d、27d、35d.

1.2实验方法

1.2.1PSA膜的制备及其降解实验

(1)PBSA共聚物的合成

在100mL的三口烧瓶中加入一定量的1,4-丁二酸、1,4-丁二醇和己二酸单体(其中1,4-丁二酸、1,4-丁二醇的摩尔比为1∶1.05,己二酸单体的量占总醇量的20%),并加入一定量的钛酸四丁酯Ti(OBu)4作为催化剂;在氮气环境下油浴加热使反应体系迅速升温至180℃,反应至脱水恒定后,逐步升温至220℃,开始抽真空2h左右至体系变粘稠,反应结束;趁热将产物从烧瓶内刮下,冷却后将其溶解于一定量的氯仿中,搅拌至充分溶解,将聚酯的氯仿溶液缓慢倒入无水乙醇中,聚酯以白色絮状物析出,即为PBSA,在40℃下真空干燥24h[12].

(2)薄膜制备及降解实验

采用开炼机制备共聚物薄膜:称取一定量的PBSA干燥待用.先将开炼机空车预热一段时间,同时进行空车加油润滑,将辊子升温至或接近温度设定值时,将制得的PBS基共聚物粉末添加到开炼机上制成平均厚度约为0.20mm厚的光滑薄膜,然后裁成1.5cm×2.5cm大小的试样,用蒸馏水清洗,40℃真空干燥至恒重备用[13].

1.2.2共聚物的酶催化降解

首先配制pH为7.0±0.01,浓度为0.05mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液,备用.将干燥好的1.5cm×2.5cm薄膜试样放入50mL的离心管中,然后加入12mL脂肪酶活力为6000U/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲溶液,密封后置于恒温水浴振荡器中进行酶催化降解实验,设定转速为120r/min,温度为50℃.并且每组降解实验设置三组平行实验,以不加脂肪酶的实验为空白对照组.定时取样,后用蒸馏水洗干净,并在40℃的温度下真空干燥至恒重,待测.

1.2.3质量损失率计算

PBSA薄膜降解前后的质量变化代表PBSA的质量损失率,质量损失率(Mass%)按式(1)进行计算.

Mass%=m0−mtm0×100%         (1)

式(1)中:m0-降解前薄膜的原始质量(g);mt-降解后薄膜的剩余质量(g).

1.2.4相对分子质量及分布测试

采用凝胶渗透色谱(GPC)(三氯甲烷为流动相,样品浓度约为3mg/mL,流速1.0mL/min,柱温40℃,示差折光检测器,进样量为20μL,聚苯乙烯为标样)进行相对分子质量测试.

1.2.5降解产物成分分析

PBSA的降解产物成分采用飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行测试.采用美国BrukerDaltonics公司的BIFLEXIII,氮分子激光,波长355nm,基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-CHCA,分子量为189.17).

1.2.6青菜种子发芽实验方法

选择颗粒饱满的青菜种子;取陕西科技大学花园土装于营养钵中,每钵100g土,把PBSA粉末以质量分数2.2%的比例与土壤混匀配制,每种处理样重复3组,并设置空白对照.每盆播种青菜种子20粒,在光照培养箱内培养,培养条件为恒温25℃、相对湿度75%,12h光照/12h黑暗周期培养.每日记录发芽数,培养7d后,测定每株的根长、苗长.

1.2.7青菜生长周期实验方法

将青菜种子播种在营养钵中进行培养,待长出3～4片真叶时记为第一天.取陕西科技大学花园土装于营养钵中,每钵100g土,把PBSA粉末以质量分数2.2%的比例与土壤混匀配制,每种处理样重复3组,并设置空白对照.于不同生长期(定植后0d、11d、27d、35d)取样后,采用考马斯亮蓝法测定叶片中可溶性蛋白质的含量[5]、丙酮法测定叶绿素含量[14]、硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)的含量[14]、愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)含量[14].

2、结果与讨论

2.1PBSA的质量损失率

从图1可以看出,己二酸和己二醇含量为20%时,降解5d后薄膜的降解速率已接近100%,且聚酯的降解呈先快后慢的趋势,这是由于降解到后期脂肪酶活性降低,降解速率变慢.改性后的聚酯降解性提高,是由于第三组分的加入,打破了PBSA分子链的有序结构,使聚合物主链结构更加松散,酶可以更容易进攻,从而提高其降解性.整体比较而言,水相体系中,在PC脂肪酶的催化作用下,PBSA的质量损失率较快.相比实验组,几组空白实验的降解率基本为零,表明降解过程中基本不存在水解,PBSA的降解都是由脂肪酶对酯键的识别、进攻以及分解所致.

图1共聚物质量损失率随降解时间变化图

2.2PBSA降解前后相对分子质量随降解时间的变化

图2为水相体系中,在PC脂肪酶的作用下PBSA的相对分子质量随降解时间的变化图.由图2可以看出,随着降解时间的延长,聚合物的相对分子质量下降较为明显,可以说明PBSA发生了较为明显的降解,且有低聚物和小分子物质生成.

图2共聚物PBSA降解过程中Mn的变化图

2.3共聚物的降解产物分析

在降解过程中,共聚物PBSA的酯键发生断裂,长链的高分子逐渐变为短链的低分子或单体,故降解产物中可能存在多种成分.为进一步分析共聚物PBSA的降解产物成分,对降解产物进行了MALDI-TOF-MS测试,如图3所示,为PBSA酶催化降解产物的MALDI-TOF-MS谱图.

图3PBSA降解物的MALDI-TOF-MS谱图

图3中相对丰度较高的一系列离子峰为降解产物中低聚物与H+加合而形成的离子峰;共聚物在水相体系中酶催化降解5d后,均可产生低聚物,但PBSA降解产生的离子峰明显较多,说明己二酸的引入更利于共聚物的酶催化降解.

降解产物成分的分析结果如表1所示.共聚物降解后既产生了含BS单元的小分子物质,亦产生了含BA或HS的低聚物,同时还产生了游离态的单体,说明PC脂肪酶可以有效的识别BS型、BA型及HS型酯键,从而对其发起攻击使其断裂.值得注意的是,降解产物中不仅产生了诸如L*(SH)2S(BS)·H+和L*ABSBS·H+的线型小分子物质,还产生了聚合度为1的环状低聚物.

表1降解产物成分分析结果

2.4种子发芽实验中对幼苗的影响

由表2可以看出,与对照组相比,PBSA处理组对青菜种子的发芽势、发芽率、根长、株高、活力指数、干重等指标的促进作用均高于空白对照组,可以说明土壤中加入PBSA有利于青菜种子发芽,并且对幼苗的生长起到了一定的促进作用.杨林等[15]研究发现覆盖可生物降解地膜对茶菊的生长起到了一定的促进作用,因此可以说明,PBSA的加入有利于青菜种子的发芽,并且能够促进幼苗的生长.

表2PBSA处理对青菜种子发芽的影响

2.5生长周期实验中对青菜生长状况的影响

由表3可知,11d时,与对照组相比,PBSA处理组对叶片数无明显影响,根长、株高表现出显著的差异性,分别增加83.6%、14.5%;27d时,PBSA处理组对青菜的影响与11d一致,根长及株高分别增加3.5%、9.2%;35d时,PBSA处理组对青菜叶片数、根长的影响与对照组无显著性差异,株高增加0.87%.随着青菜生长期的延长,PBSA的降解产物对青菜叶片数没有明显影响,而对主根长和株高的促进作用明显.Gómez等[16]通过研究1-萘乙酸对根部的影响,发现根重的增加与1-萘乙酸的添加量成正比,而PBSA在降解过程中产生的低分子量有机酸与1-萘乙酸化学性质相似,这可以说明PBSA在降解过程中所产生的降解产物能够对根长和株高出现应激性的促进作用.

表3PBSA对青菜生长的影响

2.6生长周期实验中对青菜鲜重、干重的影响

由表4可以看出,与对照组相比,PBSA处理组对青菜地上、地下鲜重及地上干重的影响在整个生长周期内均表现出显著的差异性,呈现促进作用,随着青菜生长期的延长,PBSA处理组对青菜鲜重、干重的影响与对照组呈现出显著性差异,在27d时,促进作用最明显,范仲卿等[17]通过研究腐植酸对油菜生长发育的影响,发现腐植酸的加入能够显著提高油菜的鲜重、干重.腐植酸是一种显弱酸性的高分子化合物,而PBSA在降解过程中也会产生低分子量有机酸,两者化学性质相似.因此,可以说明PBSA的加入对青菜地上、地下部分的干、鲜重质量具有促进作用.

表4PBSA对青菜鲜重、干重的影响

2.7生长周期实验中对叶片中可溶性蛋白质含量的影响

从图4可以看出,与对照组相比,PBSA处理组的蛋白质含量在青菜生长前期低于对照组含量,随着生长周期的延长,差异性逐渐减小.在11d时PBSA处理组对青菜叶片中可溶性蛋白质含量表现为抑制作用,在27d时PBSA处理组对青菜叶片中可溶性蛋白质含量的抑制作用减小,而在35d时PBSA处理组对青菜叶片中的可溶性蛋白含量的抑制作用消失.陈明霞等[18]通过研究多效唑PP333对怀地黄叶片中可溶性蛋白质含量的影响,发现PP333对叶片中可溶性蛋白质含量具有促进作用,PP333是一种醇类物质,而PBSA在降解过程中会产生含有-OH的低聚物,与PP333具有相似的化学性质.这说明PBSA在降解过程中,其降解产物能够参与蛋白质的合成和某些酶的活性调节,使得前期形成抑制作用逐渐降低,缓解蛋白质的降解.

图4PBSA对叶片中可溶性蛋白质含量的影响

2.8生长周期实验中对叶片中叶绿素含量的影响

从图5可以看出,与对照组相比,PBSA处理组的叶绿素含量表现出显著的差异性.在11d时PBSA处理组对青菜叶片中叶绿素质量浓度的影响不明显,随着青菜生长周期的延长,在27到35d时,PBSA处理组对青菜叶片中叶绿素质量浓度促进作用逐渐增加.李佳琪等[19]通过研究褐藻寡糖对黄瓜叶片中叶绿素的影响,发现褐藻寡糖能够显著提高叶绿素含量,褐藻寡糖是由褐藻胶经降解后得到的具有-COOH的低聚物,而PBSA在降解过程中也会产生不同类型的酸性低聚物.这说明,在青菜生长周期过程中,随着PBSA的降解,其降解产物对叶绿素质量浓度产生了一定的促进作用,且随着青菜生长周期的延长,促进作用逐渐明显.

图5PBSA对叶片中叶绿素含量的影响

2.9生长周期实验中对叶片中丙二醛(MDA)含量的影响

由图6可以看出,与对照组相比,在11d时PBSA处理组低于对照组的MDA含量,在27d时PBSA处理组高于对照组的MDA含量,在35d时PBSA处理组低于对照组的MDA含量,可以看出在青菜生长周期内,随着生长周期的延长,PBSA处理组对MDA含量的影响呈现先增加、再降低并趋于稳定的趋势.郭小境等[20]通过研究发现酸性环境能够启动植物体过氧化物酶及其同工酶的工作.这可能因为在27d前,PBSA的降解产物被植物根部快速吸收,并被运输到植物地上部分,使得植物体内的活性氧自由基(ROS·)含量上升,在此之后PBSA的降解产物形成的酸性环境使得植物体内过氧化物酶及其同工酶启动,使得植物体内的ROS·含量逐渐减少.

图6PBSA对叶片中MDA含量的影响

2.10生长周期实验中对叶片中过氧化物酶的活性的影响活性的影响

从图7可以看出,与对照组相比,前期时PBSA处理组的POD活性低于对照组,随着生长周期的延长,POD活性与对照组的差距逐渐减小,最终达到一个稳定的状态.Mekawi等[21]通过研究发现水杨酸能够有效提高辣椒果实的抗氧化性,而PBSA的降解产物多为有机酸,与水杨酸化学性质相似.这说明,在青菜生长前期,PBSA的加入对POD活性的影响不大;而在生长后期,由于PBSA的降解产物提高了POD活性,使得植物体内的ROS·含量逐渐减少,降低了ROS·对青菜的抗氧化伤害,提高了青菜的抗逆性.

图7PBSA对叶片中POD活性的影响

3、结论

(1)PBSA的添加有利于青菜种子的发芽.

(2)在生长周期过程中,PBSA的添加能够促进植物根部的发育、加速植株的生长以及提高叶绿素浓度,并对叶片中可溶性蛋白质的降解过程有效缓解;虽然PBSA在前期会对青菜造成过氧化伤害,但是POD活性相应的提升能够提高植物的抗逆性、抵御过氧化伤害.

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基金:中国轻工业绿色塑料成型技术与质量评价重点实验室开放研究课题重点项目(BS201703).