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油棕硼转运通道蛋白基因NIP5的克隆

2021-03-29 162 上传者：管理员

摘要：为了研究油棕硼转运的机制，以期为后续硼高效油棕品种筛选提供理论依据。以功能明确的拟南芥AtNIP5;1序列为参考，克隆了油棕硼转运通道蛋白EgNIP5;1基因的全长序列，并对其基因结构、序列特征、进化关系、跨膜结构和表达模式进行分析。EgNIP5;1的开放阅读框长度为894bp，编码297个氨基酸；EgNIP5;1具有NIP保守的NPS、NPV和Ar/R位点，包含4个外显子3个内含子，具有5个跨膜结构。进化分析发现EgNIP5;1与可可TcNIP5的亲缘关系较近。荧光定量PCR分析发现EgNIP5;1主要在油棕根部表达，其表达量受到低硼的诱导，在缺硼处理48h达到最大值，是对照的8.2倍。该实验表明EgNIP5;1可能参与油棕缺硼的响应，在硼的吸收中起着重要的作用。

关键词：
基因克隆
基因表达
油棕
硼转运通道蛋白
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硼是植物生长和发育必需的微量元素之一。硼在植物中的直接功能是参与植物细胞壁建成，桥接细胞壁和细胞膜；间接功能有参与糖类的运输、核酸的合成、生长素代谢、花粉管的发育、细胞膜的稳态以及光合作用等[1,2,3]。缺硼会导致植物出现新叶枯死，老叶扭曲、变脆，叶脉木栓化破裂，花而不实，果实流胶等症状[4,5]，增施硼肥能够有效提高玉米、甜菜和油菜的产量[6,7,8]。植物根系吸收硼的方式主要有三种，一是通过被动扩散直接穿过磷脂双分子层进入根部，这是植物吸收硼的最主要的方式；二是利用水通道蛋白（majorintrinsicprotein,MIP）对硼进行易化扩散运输；三是消耗能量通过硼转运蛋白（borontransport,BOR）对硼进行高亲和力的主动运输[9]。Takano等[10]首先在拟南芥中分离出编码转运硼酸的水通道蛋白基因AtNIP5;1，缺硼胁迫下该基因在根尖伸长区和根毛中的表达量剧烈上调；在非洲蟾蜍卵母细胞中表达分析发现AtNIP5;1具有协助硼酸向胞内运输的功能，超量表达能提高转基因植株在低硼环境下的硼吸收能力。随后在水稻[11]、柑橘[12]、油菜[13]、猕猴桃[14]等作物中都相继对NIP5进行分离和功能鉴定，这些研究表明NIP5作为硼通道蛋白在植物缺硼胁迫中对硼吸收起着重要的作用。Feng等[15]在油菜中鉴定了调控硼转运通道蛋白的转录因子，WRKY47通过上调BnaA3.NIP5;1的表达，提高油菜对硼的吸收能力，增强对低硼的耐受性。油棕是世界上最高产的油料作物，棕榈油平均产量为5000～7000kg/hm2，是花生的5～6倍、大豆的9～10倍[16]。油棕周年开花结果，生长量大，一株油棕每年积累的干物质重量高达240kg，因此油棕每年从土壤中带走大量养分，除了氮、磷、钾、钙、镁、硫等大量元素外，还有铁、锰、锌、铜、硼、钼、氯等微量元素[17]。硼在油棕的生长发育中起重要作用，缺硼会导致油棕小叶畸形扭曲，叶尖处倒钩，果实中的种仁发育受阻形成空壳，进而导致油棕产量和品质的下降[17]。油棕主要分布在热带地区包括非洲的中西部，南美洲的中北部，亚洲的东南部，这些地区土壤硼含量较低，而且热带地区降雨量大易导致土壤硼的流失[18]。硼是油棕生长发育必不可少的微量元素，但与油棕硼转运蛋白相关的的分子机制研究还少见报道，随着油棕基因组的公布[19]，克隆编码油棕硼转运蛋白的基因并分析其生物学功能成为可能。本研究从油棕厚壳种中克隆了EgNIP5;1基因，对其基因结构、序列特征、进化关系和跨膜结构进行分析，同时采用荧光定量分析其在油棕缺硼胁迫下的表达模式，为后续油棕硼吸收规律研究及硼高效油棕品种筛选提供理论依据。

1、材料与方法

1.1供试材料及缺硼处理

实验材料为厚壳种油棕(Elaeisguineensis)，种子采自中国热带农业科学院椰子研究所基地(19°33'N,110°47'E)。将油棕种子置于39℃的恒温培养箱中进行催芽，待种子萌芽后，置于蛭石中育苗。幼苗长至4片真叶后，选取长势一致，无病虫害的幼苗采用水培的方式进行培养。幼苗先用自来水进行1周的适应性培养，然后依次更换为1/4,1/2和全营养液培养。待幼苗适应水培环境后（有新根长出）进行缺硼处理。缺硼处理以硼缺乏(0.001mg/L)的Hoagland和Aron营养液进行培养，对照为正常的营养（硼含量0.25mg/L）。水培设置通气装置，每1h通气15min，每5天更换一次营养液。每盆4株幼苗为一个重复，每个处理设置3个重复。在缺硼处理0、24、48、72h和恢复足量硼供应后48h，分别采集处理和对照的根尖样品液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存。实验于2019年4月—2019年5月在中国热带农业科学院椰子研究所进行。

1.2基因挖掘及生物信息学分析

从NCBI中下载拟南芥AtNIP5;1(AT4G10380)基因的氨基酸序列，在油棕基因组数据库中采用BLSATP进行比对分析获得与AtNIP5;1高度同源序列，下载其氨基酸，mRNA以及gDNA序列。采用ORFfinder在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析开放阅读框，采用Primer-BLAST在线工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK＿LOC=BlastHome)进行引物设计，采用GeneStructureDisplayServer2.0在线工具(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)进行基因结构分析，采用SequenceManipulationSuite在线工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/index.html)进行蛋白质序列分析，采用GeneDoc软件进行基因序列比对分析，采用MEGA6软件进行进化分析。

1.3硼含量的测定

油棕根尖硼含量采用姜黄素比色法测定[20]。具体方法如下：称取0.5g干样，加1mol/L的稀盐酸20mL提取24h，吸取1.0mL提取液于30mL的陶瓷蒸发皿中，加2mL姜黄素-草酸溶液（0.05g姜黄素与5.0g草酸溶于100mL95%的乙醇中），置于70℃水浴蒸干，立即转移至70℃烘箱烘干0.5h，取出后立即放入干燥器中，逐一取出加入20mL95%的乙醇溶解，同时配制标准系列溶液，以相应试剂空白作为参比，测定550nm处的吸光度。

1.4核酸提取及基因表达分析

总RNA采用柱式植物总RNA抽提纯化试剂盒（上海生工）进行提取，cDNA采用（南京诺唯赞）HiScriptII1stStrandcDNASynthesis试剂盒进行合成，具体步骤参照试剂盒的操作说明进行。荧光定量PCR采用SYBR®SelectMasterMix(LifeTechnologies)进行分析，以β-actin作为内参基因，反应体系参照试剂盒的操作说明进行，引物序列（表1）。

表1基因全长克隆及荧光定量PCR引物

1.5数据分析

本研究采用SPSS13.0进行数据分析，用Ducan检测法进行硼含量和基因表达的差异显著性分析。

2、结果与分析

2.1EgNIP5;1的克隆及生物信息学分析

以油棕根尖cDNA为模板，以NIP5;1F和NIP5;1R为引物进行基因的全长扩增，获得一条单一条带，长度在1kb和2kb之间（图1）。测序结果显示条带碱基长度为1182bp，其中ORF长度为894bp，编码297个氨基酸。对其基因结构分析，发现含有4个外显子和3个内含子（图2）。对氨基酸序列进行分析，发现EgNIP5;1的氨基酸分子量为30.74kDa，等电点为8.81。对EgNIP5;1的蛋白保守结构进行分析发现，EgNIP5;1蛋白具有2个典型的保守结构NPS(Asn-Pro-Ser)NPV(Asn-Pro-Val)位点（图3）。进化分析发现EgNIP5;1与AtNIP5;1,CiNIP5和TcNIP5聚在一个进化支上，序列相似度分别为70%,71%和77%（图4）。对其跨膜结构进行分析，发现EgNIP5含有5个跨膜结构（图5）。

图1EgNIP5;1基因全长PCR扩增

图2EgNIP5;1基因结构

2.2缺硼胁迫下油棕根尖硼含量及EgNIP5;1的基因表达

对缺硼胁迫下油棕根尖的硼含量进行测定发现，硼含量随缺硼胁迫时间的延长逐渐降低，在缺硼48h和72h的根尖硼含量为13.28mg/kg和12.14mg/kg，显著低于对照(17.59mg/kg)；恢复供硼48h根尖的硼含量恢复至16.27mg/kg，略低于对照（图6）。利用荧光定量PCR对EgNIP5;1在油棕不同组织的表达模式进行分析，发现EgNIP5;1在根中的表达量显著高于茎和叶（图7A）。对缺硼胁迫下EgNIP5;1在根尖中的表达模式进行分析，发现缺硼处理后EgNIP5;1的表达量逐渐增高，在缺硼胁迫后48h达到最高值是对照的8.2倍。恢复供硼48h后EgNIP5;1表达量迅速降低，其表达量与缺硼0h无显著差异（图7B）。

3、讨论与结论

NIPs(nodulin26-likeintrinsicproteins)家族属于水通道蛋白MIP(Membraneintrinsicproteins)家族的亚家族之一，能运输硼酸和尿素等小分子物质，例如拟南芥AtNIP4;1、AtNIP5;1、AtNIP6;1和AtNIP7;1[10,21,22,23]，水稻的OsNIP3;1（与AtNIP5;1同源）能够运输硼酸[11]，西葫芦的CpNIP1能够运输尿素[24]。nip5突变体在足量硼条件下的表型与野生型无差异，但在低硼条件下植物生长受到明显抑制[10]；在烟草中超量表达CiNIP5能显著提高转基因植株在低硼条件的硼吸收能力，其植株生物量显著高于野生型[25]，表明NIP5主要在低硼条件将环境中的硼转运至植物体内。本研究采用同源克隆的方式获得油棕EgNIP5;1的基因全长，序列比对分析发现EgNIP5;1具有与拟南芥、水稻、柑橘、可可等植物相同的NPS、NPV和Ar/R位点。油棕与拟南芥、水稻、柑橘、可可等物种的进化分析发现EgNIP5;1与可可TcNIP5进化关系最近，表明二者具有相似的功能。跨膜结构分析发现其编码的蛋白具有5个跨膜区，这与在拟南芥[10]、烟草[26]和柑橘[25]上的研究结果一致。因此推测克隆的序列为编码硼酸通道蛋白的基因。

图3拟南芥、水稻、柑橘、可可和油棕的NIP氨基酸序列

图4EgNIP5;1的进化关系

图5EgNIP5;1蛋白跨膜结构预测

图6不同时间点油棕根尖硼含量

NIP5;1在柑橘[25]和猕猴桃[14]根中的表达量显著高于茎和叶；在水稻中的研究发现正常硼条件下OsNIP3;1在根和茎中的表达量无差异，而在缺硼胁迫下根中的表达量迅速上调，且表达量显著高于茎[11]，这表明NIP5;1是植物根中吸收硼的主要通道蛋白。本研究中油棕的EgNIP5;1在根中的表达量显著高于叶和茎，表明其主要参与根尖对硼的吸收，这与柑橘和猕猴桃中研究结果一致。NIP5;1的表达对缺硼反应迅速，在拟南芥中缺硼3h时AtNIP5;1的表达量就显著高于对照，在缺硼24h达到峰值随后表达量略微降低；在恢复供硼后，其表达量也恢复至对照水平[10]。在本研究中，油棕根尖的硼含量随着缺硼时间的延长逐渐降低；EgNIP5;1的表达量也迅速上升，在缺硼48h达到峰值；恢复供硼后，根尖的硼含量升高，EgNIP5;1的表达量迅速降低。这表明EgNIP5;1的表达受到外界硼含量的调控，在缺硼环境下通过上调表达增强对硼的吸收能力，当硼含量恢复至正常水平时，EgNIP5;1的表达量恢复至正常水平。本研究通过生物信息学分析和基因表达分析推测EgNIP5;1具有硼转运的功能，后续还需要采用转基因实验明确其生物学功能，同时鉴定控制EgNIP5;1的转录因子，明确其调控机制，进而为后续筛选油棕硼高效品种奠定理论基础。

图7EgNIP5;1的基因表达

综上所述，本研究首次在油棕中克隆到编码硼转运通道蛋白的基因EgNIP5;1，生物信息学分析发现其具有NIP5基因的特征，基因表达分析发现其主要在根中表达，在缺硼条件下上调表达，恢复供硼后表达量降低，初步推测其具有硼转运的功能。

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