紫花苜蓿(Medicagosativa)作为我国乃至世界上栽培种植最为广泛的人工牧草[1],在我国干旱、半干旱气候区被大面积种植[2],被誉为“牧草之王”。中国市场苜蓿干草从美国西部的进口量占美国西部干草出口量的比例从2008年的1.4%快速上升到2016年的47.1%以上[3],这表明苜蓿在我国市场有巨大的发展潜力。而内蒙作为大量种植紫花苜蓿的区域,其土壤干旱沙化现象严重、保水性差,而紫花苜蓿虽然成株期具有根系发达、抗旱性强的特点,但苗期易受干旱胁迫的影响[4],因此如何提高紫花苜蓿的出苗率和幼苗存活率对发展紫花苜蓿种植业十分重要。

印度梨形孢(Pirifomosporaindica)是印度科学家VERMA等[5]在印度塔尔沙漠的灌木根内分离得到的一种内生真菌,其主要特点是只形成厚垣孢子,典型的厚垣孢子是梨形[6]。印度梨形孢能够广泛的定殖于单子叶和双子叶植物的根部,促进植物生长,增加植物的生物量,并提高植物对逆境胁迫的忍耐性,诱导植物产生系统抗性[7]。吸水树脂又称水凝胶、超强吸水剂[8],它具有优良的吸水能力和保水能力,能够迅速吸收比自身重数百倍乃至千倍的液态水[9],鉴于这些优点,吸水树脂可用于提高沙土的保水性能。

目前,关于印度梨形孢真菌的研究主要集中在对植物的生长促进、提前开花、提高产量及病虫害防治等方面[10,11,12,13,14,15,16,17,18,19]。关于印度梨形孢提高紫花苜蓿抗逆性方面的研究甚少,特别是对紫花苜蓿幼苗在内蒙沙土中生长情况观察方面鲜有报道。该试验以紫花苜蓿种子作为研究对象,以内蒙沙土为基质,以改善土壤保水性和提高作物抗逆性为出发点,加入印度梨形孢和吸水树脂,观察紫花苜蓿幼苗生长情况,以期提高内蒙沙土保水能力,增强紫花苜蓿的抗逆性,为紫花苜蓿种植业的可持续发展提供科学参考依据。

1、材料与方法

1.1试验地概况

内蒙古赤峰市平均海拔400～500m,地处东经119°32′～120°51′,北纬41°43′～43°05′。属于温带干旱半干旱大陆性季风气候区,年平均降水量350mm,蒸发量2450mm,年日照时数2900h。

1.2试验材料

供试印度梨形孢菌液由西南大学生命科学学院杨应斌副教授提供,供试紫花苜蓿种子由西南大学动物科技学院胡艳老师提供。供试沙土采自内蒙古赤峰市内。

将印度梨形孢接种在PDA固体培养基上,在30℃培养箱中黑暗培养72h进行活化培养。切取PDA固体培养基上的小块真菌菌丝块,接种到PDA液体培养基进行增殖培养,置于恒温摇床,转速为150r·min-1,温度为28℃,黑暗培养7d。获得印度梨形孢菌液备用。

1.3试验方法

1.3.1试验设计

试验采用内蒙沙土为基质,设置以下4个处理:对照(CK)、加入树脂(CR)、接种印度梨形孢(CP)、接种印度梨形孢并加入树脂(PR),每处理重复5次。

1.3.2紫花苜蓿播种

将精选的紫花苜蓿种子,用温水浸泡20min后,播于装好灭菌沙土的培养皿内。加入树脂的处理,将树脂以1kg沙土1g树脂的比例混合在沙土中。每个培养皿播种50粒,于光照培养箱中培养,温度为(23±2)℃,光照时间16h。

1.3.3接种印度梨形孢及树脂与定殖检测

待紫花苜蓿出苗后,将含有印度梨形孢菌丝体的菌液以1kg沙土40mL菌液的比例浇灌于培养皿中。待印度梨形孢与紫花苜蓿共同培养20d后,随机选取紫花苜蓿幼苗根系,用自来水冲洗干净后再用蒸馏水冲洗3遍,剪成1cm长小段,经10%NaOH浸泡过夜后洗净,再经1%HCl浸泡5min后洗净,最后用0.05%乳酸石炭酸棉蓝染色液染色制片,在光学显微镜下观察印度梨形孢真菌定殖情况并记录[20]。定殖成功后,开始控水,通过称质量法控制土壤水分到接近于试验所用沙土的含水率即6%～8%。持续培养10d后,测定各项指标。

1.4项目测定

幼苗高度、根系长度等用直尺测定,幼苗地上部鲜质量、地上部干质量、根鲜质量、根干质量用千分之一电子天平称量。幼苗丙二醛(MDA)、游离脯氨酸(Pro)含量以叶片为材料采用分光光度法[21]测定。

1.5数据分析

试验数据利用SPSS21.0软件进行平均数统计和水平间差异分析(Duncan′s新复极差法),利用Origin86软件对平均数和差异性作图。

2、结果与分析

2.1印度梨形孢在紫花苜蓿根部定殖

印度梨形孢与紫花苜蓿共同培养20d后,在40×显微镜下可观察到印度梨形孢真菌在紫花苜蓿根部细胞间和细胞内定殖,其椭圆形的厚垣孢子如图1箭头所示。共检测120段1cm长度的接种印度梨形孢的紫花苜蓿幼苗根段,检测到孢子的小段数有103段,定殖率为85.8%。

2.2印度梨形孢和树脂对紫花苜蓿幼苗地上部生长的影响

从表1可以看出，CK、CR、CP、PR的株高分别为8.13、10.17、10.37、10.06cm，其中CK与其它3个处理间差异显著（P<0.05),CR、CP、PR3个处理间没有显著差异；地上部鲜质量分别为0.044、0.063、0.057、0.082g，其中CK与其它3个处理间差异显著（P<0.05),CR、CP2个处理间没有显著差异；PR处理与其它3个处理间差异显著（P<0.05）；地上部干质量分别为0.009、0.011、0.012、0.016g，其中CK与其它3个处理间差异显著（P<0.05),CR、CP2个处理间没有显著差异；PR处理与其它3个处理间差异显著（P<0.05）。因此，与CK处理相比，CR、CP、PR处理对紫花苜蓿幼苗的株高、地上部鲜质量、地上部干质量均有显著促进作用。

图1印度梨形孢在紫花苜蓿根部定殖

表1印度梨形孢和树脂对紫花苜蓿幼苗地上部生长的影响

2.3印度梨形孢和树脂对紫花苜蓿幼苗根部的影响

由表2可知,CK、CR、CP、PR处理的根长分别为9.10、10.67、11.10、12.57cm,CR、CP、PR3个处理与CK差异显著(P<0.05),但CR与CP处理差异不显著;根鲜质量分别为0.051、0.062、0.064、0.075g,处理间差异与根长相同;PR处理的根干质量最大,为0.012g,与其它3个处理对比均达到显著水平(P<0.05)。由此而得,与CK相比,CR、CP、PR处理对紫花苜蓿幼苗根系生长具有显著的促进作用。

表2印度梨形孢和树脂对紫花苜蓿幼苗根系生长的影响

2.4印度梨形孢和树脂对紫花苜蓿幼苗Pro和MDA含量的影响

由图2可知,与CK处理相比,CR处理的幼苗脯氨酸含量提高了4.07%,CP处理的幼苗脯氨酸含量提高了77.65%,PR处理的幼苗脯氨酸含量提高了83.43%,处理间差异显著;与CK处理相比,CR处理的幼苗丙二醛含量降低了16.05%,CP处理的幼苗丙二醛含量降低了20.83%,PR处理的幼苗丙二醛含量降低了26.04%,4个处理间差异显著(P<0.05)。

图2紫花苜蓿幼苗叶片游离脯氨酸含量

图3紫花苜蓿幼苗叶片丙二醛含量

3、讨论与结论

已有研究结果表明,印度梨形孢在植物的根系表层细胞间以菌丝卷、分枝或圆形体的形式定殖[22],能有效促进龙眼幼苗[23]、芹菜[24]、生菜[25]、蒺藜苜蓿[26]、烟草[27]、芝麻[28]、玉米[29]、棉花幼苗[30]、旱稻幼苗期[31]的生长;杨亚珍等[32]发现在莴苣种植的苗期施加印度梨形孢菌剂,可显著提高莴苣的产量和品质。该试验结果表明,与空白对比,接种印度梨形孢能够显著促进紫花苜蓿幼苗的地上部以及根系的生长。吸水树脂可以有效改善土壤结构,使土壤大团聚体数目增加,增大土壤表面粗糙度,降低土壤容重,增加土壤总孔隙度和毛管孔隙度,进而使土壤颗粒和空隙结构保持稳定,提高土壤的透气性和透水性[33],黄占斌等[34]发现吸水树脂的保水性能使农作物的生长更加良好,产量得到大幅度提高。该试验结果表明,与空白对比,加树脂对紫花苜蓿幼苗的地上部和根系生长具有显著的促进作用,说明树脂的加入有效地提高了沙土的保水性能,使幼苗能够充分吸收水分,促进了幼苗在沙土上的生长。

渗透调节是植物抵抗干旱、盐碱等逆境胁迫的一种重要机制[35,36]。在植物遭遇干旱胁迫时,作为一种渗透调节物质,游离脯氨酸会在植物体内大量积累,来调节渗透压,维持植物正常的生长代谢,其积累指数与植物的抗逆性呈正相关[37]。惠非琼等[38]发现印度梨形孢能提高烟草的抗旱能力,是通过降低烟草细胞生物膜的损伤程度、增强烟草的抗氧化防御能力、促进细胞渗透调节物质Pro的积累以及上调干旱胁迫相关基因的表达来实现的;李亮等[39]通过分子生物学试验表明该真菌可诱导脯氨酸合成酶基因(P5CS)的表达来增强紫花苜蓿的耐盐害能力。该试验结果表明,接种印度梨形孢能够显著提高紫花苜蓿幼苗叶片脯氨酸含量,维持沙土上紫花苜蓿幼苗的正常生长,提高紫花苜蓿幼苗地上部及地下部生长量。在干旱胁迫下,植物细胞会发生膜质过氧化作用,丙二醛就是其次生代谢产物,丙二醛含量也用来反应膜脂过氧化和植物遭受逆境伤害的程度[40]。该试验结果表明,接种印度梨形孢显著降低了丙二醛含量,说明接种印度梨形孢,能够有效地增强紫花苜蓿幼苗的抗逆性,促进幼苗的生长。

只加树脂与只接种印度梨形孢2个处理比较,其对幼苗地上部生长以及根长和根鲜质量的促进作用没有显著差别,但只接种印度梨形孢的处理幼苗脯氨酸含量提高了77.65%,而只加树脂的处理对幼苗脯氨酸含量仅提高4.07%;2个处理幼苗丙二醛含量差异显著,只接种印度梨形孢的处理幼苗丙二醛含量下降更为显著,说明接种印度梨形孢更能促进紫花苜蓿幼苗在内蒙沙土上的生长。

接种印度梨形孢能显著提高紫花苜蓿幼苗叶片脯氨酸的含量,降低丙二醛含量,增强紫花苜蓿幼苗的抗逆性,显著促进内蒙沙土上紫花苜蓿幼苗地上部和地下部的生长。

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基金:国家自然科学基金资助项目(41301315);重庆市自然科学基金资助项目(Cstc2019jcyj-msxmX0304);西南大学基本科研业务费专项资金重点资助项目(XDJK2019B072)