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抗条锈病小偃麦附加系CH366的FISH鉴定

2021-03-19 259 上传者：管理员

摘要：利用小麦-中间偃麦草部分双二倍体TAI7045与普通小麦晋太170进行亚远缘杂交选育的小偃麦新种质CH366高抗小麦条锈菌条中32、条中33和条中34号生理小种，为了追踪其抗条锈病基因来源，对CH366及其亲本接种条锈菌生理小种，并对CH366进行了荧光原位杂交(FISH)鉴定。结果表明，CH366和TAI7045对条锈病表现为近免疫和免疫，其小麦亲本晋太170则表现为高感，证明CH366的条锈病抗性来源于TAI7045;FISH鉴定表明，CH366中含有44条染色体，其中，42条来源于晋太170，另2条来源于TAI7045的中间偃麦草染色体。CH366是一个小麦-中间偃麦草二体异附加系，可作为小麦抗条锈病遗传改良的中间亲本。

关键词：
FISH
中间偃麦草
小麦
抗条锈病
附加系
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小麦条锈病是由条锈病菌引起的靠风力传播的毁灭性病害，具有传播迅速、传播范围广、产量损失大的特点，严重危害了我国小麦的生产[1]。近年来，由于种植结构的改变，大量矮秆的小麦品种投入生产，使得株间环境更适合条锈病原菌传播，条锈病危害日益严重。由于条锈病小种的变异使得已有的抗条锈病基因逐渐丧失抗性，选育新的小麦抗条锈病基因资源并将其应用于育种与生产是解决条锈病危害的有效途径[2]。

中间偃麦草作为小麦的近缘物种，是小麦改良的三级基因源之一，抗寒，分蘖能力强，蕴含丰富的抗病基因。目前普遍认为，中间偃麦草的基因组型为JJJsJsSS，其中，J基因组、JS基因组与小麦的B基因组十分接近，因此，容易与小麦杂交，中间偃麦草应用十分广泛[3]。H.B.齐津[4]将小麦与中间偃麦草进行远缘杂交，选育出小冰麦系列新品种；孙善澄[5]利用小麦与中间偃麦草多次杂交后回交并定向选择的方法选育出中1～中5，在抗病方面的应用非常广泛。CHANG等[6]利用普通小麦与中间偃麦草杂交获得TAI7044、TAI7045、TAI8335等多个八倍体小麦，并继续与小麦杂交、回交，选育出CHadd7001、CHadd7002[7]、CH13-21[8]等多抗性附加系与易位系。石丁溧等[9]选育出抗白粉病和条锈病的异附加系AF-2，并通过GISH证明了有2条染色体来源于中间偃麦草。

CH366是山西农业大学农学院利用普通小麦晋太170与小麦-中间偃麦草部分双二倍体TAI7045杂交，F1代与晋太170再回交，回交后代经过多次自交得到的体细胞为44条染色体的小偃麦新品系。本研究通过细胞学方法对CH366进行了荧光原位杂交（FISH）鉴定，同时进行抗病性分析，以期为小麦遗传改良与抗病育种提供稳定且优良的中间材料。

1、材料和方法

1.1试验材料

供试材料CH366、亲本晋太170、TAI7045和对照品种台长29、SY95-71均由作物遗传与分子改良山西省重点实验室保存并提供。CH366是由晋太170与TAI7045杂交后回交得到；TAI7045是由畅志坚用普通小麦和中间偃麦草杂交培育的部分双二倍体；晋太170是由山西省农业科学院作物科学研究所选育的国审优质强筋小麦品种。

1.2染色体制片

有丝分裂中期染色体制片参考HAN等[10]的方法，略有改动。取50粒CH366种子在4℃冰箱放置2d，室温下晾干。放在5个培养皿中培养，每个培养皿铺2层滤纸润湿后放入10粒种子，在室温黑暗环境下培养2d。待根尖长到2cm左右，放入4℃冰箱处理24h。在每粒种子上剪取1cm左右的根尖分别放到2mL喷湿离心管中，然后在0.9MPaN2O罐处理2h。用90%醋酸固定10min，水洗3次，切取根尖分生区置于2%的果胶酶和纤维素酶中，37℃水浴60～65min。取出后用70%乙醇洗2次，无水乙醇洗1次。用解剖针捣碎根尖后，4000r/min离心3min。倒掉乙醇后在室温下晾干，然后加入适量冰醋酸，搅拌均匀后用移液器吸取6.5μL混合液滴于载玻片上，15min后用显微镜观察染色体中期分裂相，选取染色体完整且分散好的片子保存。

1.3荧光原位杂交分析

选取多聚寡核苷酸探针Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1[11]进行双色荧光原位杂交，杂交程序参照LANG等[12]的方法，并参照TANG等[11]的方法对分散的染色体进行命名。用LeicaDM2荧光显微镜进行镜检，DFC500CCD拍照。选择分裂相明显且清晰的细胞进行核型分析，以获得可靠的证据。

1.4抗病性鉴定

2019—2020年度分别在四川省农业科学院现代农业科技示范园和山西农业大学东阳试验示范基地种植亲本晋太170、TAI7045和CH366。在四川成都基地人工接种条锈菌最新流行小种条中32、条中33、条中34混合小种，感病对照选择台长29，诱发品种为川育12，进行条锈病抗性鉴定。在东阳基地人工接种白粉菌株E09，感病对照是SY95-71，诱发品种为SY95-71，进行白粉病抗性鉴定。测试材料对条锈病和白粉病的抗性均按照6级反应型进行记载[13,14]，分别为0（免疫）、0；（近免疫）、1（高抗）、2（中抗）、3（中感）、4（高感）。

2、结果与分析

2.1CH366的染色体数目鉴定

取50粒CH366的种子发芽并取其根尖进行有丝分裂中期染色体制片，选取细胞完整且染色体分散好的片子进行染色体数目统计。由图1、2可知，50粒种子的染色体数目均为44条，比普通小麦的42条染色体多2条，表明CH366中可能含有2条不属于普通小麦的染色体。

2.2CH366的FISH鉴定

以分别标记了红色和绿色荧光标记的Oligo-pTa535-1和Oligo-pSc119.2-1探针对CH366进行荧光原位杂交（FISH），并对其染色体进行分组与核型分析，结果发现，CH366中有42条染色体与小麦亲本晋太170[15]染色体结构、荧光信号基本一致，另2条染色体在长臂末端和短臂上接近着丝粒的位置含有较强的红色杂交信号，与普通小麦的染色体具有明显区别。且这2条染色体形态与杂交信号完全一致，这表明CH366中含有1对来源于TAI7045或中间偃麦草的染色体，CH366可能是一个小麦-中间偃麦草异附加系。

2.3CH366的抗病性鉴定

在山西农业大学东阳试验示范基地进行CH366成株期白粉病鉴定。结果显示，TAI7045对白粉病的反应型为0级，表现为免疫；CH366和晋太170的反应型均为4级，表现为高感白粉病；说明CH366中可能不含有抗白粉病基因。在四川省农业科学院现代农业科技示范园进行CH366成株期条锈病鉴定。结果显示，晋太170对条锈病的反应型为4级，表现为高感条锈病。CH366的反应型为0；级，表现为近免疫；TAI7045的反应型为0级，表现为免疫；CH366与TAI7045的条锈病抗性基本一致，表明CH366中的抗条锈病基因可能来源于其所含有的1对外源染色体，即来源于TAI7045或中间偃麦草。

3、结论与讨论

小麦的远缘杂交可以将外源染色体导入小麦中，丰富小麦的遗传背景，创造新的种质资源，为发展小麦产业做出贡献。检验是否有外源染色体最直观、快速的方法就是原位杂交技术。建立FISH核型图可以一目了然地观察到外源染色体形态与数目。最初，TSITSIN[16]通过远缘杂交创造出小麦-中间偃麦草部分双二倍体，之后有大批附加系、代换系如雨后春笋般涌现。韩方普等[17]利用原位杂交对小偃麦异附加系TAI-14进行鉴定，发现变异的染色体来自于中间偃麦草，且附加系会再次发生变异，产生了双端体异附加系TAI-14t。杜万里[18]对一系列小麦-华山新麦草衍生后代进行原位杂交，筛选出全套二体附加系。本试验对小麦-中间偃麦草后代CH366进行了FISH鉴定和核型分析，证实CH366是一个二体异附加系，包含小麦全套基因组，并添加了2条外源染色体。添加的2条外源染色体具体类型需要使用分子标记鉴定和其他技术手段来确定。

国内外学者通过中间偃麦草与小麦杂交选育出多个对小麦抗病、抗寒等性状具有改良作用的基因资源。GAUDERON[19]育成的小麦-中间偃麦草双二倍体TAF46，对小麦冻害与春季低温具有极强的抗性；孙善澄等选育的中4和中5[5]含有黄矮病的抗性；LIU等[20]利用普通小麦烟农15与中间偃麦草育成的部分双二倍体E990256，高抗白粉病。部分双二倍体由于含有较多的外源染色体，农艺性状普遍较差，难以在育种或生产上直接应用。附加系作为外源基因向小麦转移的中间材料，仅含有1对外源染色体，减少了外源染色体对小麦基因组的影响，更易于与小麦杂交，因此，附加系的选育对创制新的小麦种质资源、扩展小麦遗传基础具有重要意义。本试验选育并鉴定的异附加系CH366对条锈病表现为近免疫，其小麦亲本晋太170高感条锈病，因此，推测其条锈病抗性来自其所含有的外源染色体，即其抗条锈病基因来自中间偃麦草。但CH366作为一个二体异附加系，仍含有较多的外源染色体，易受外源物种不良基因的影响，不利于在小麦育种中应用，因此，在生产实践中，需要利用其与普通小麦再次杂交，利用ph1b基因诱导或辐射技术，依次创造出代换系和含有不良外源基因较少的小片段易位系。

参考文献：

[2]康振生,王晓杰,赵杰,等.小麦条锈菌致病性及其变异研究进展[J].中国农业科学,2015,48(17):3439-3453.

[3]王洪刚,刘树兵,亓增军,等.中间偃麦草在小麦遗传改良中的应用研究[J].山东农业大学学报(自然科学版),2000,31(3):333-336.

[4]H.B.齐津.多年生小麦[M].北京:农业出版社,1982.

[5]孙善澄.小偃麦新品种与中间类型的选育途径､程序和方法[J].作物学报,1981,7(1):51-58.

[7]张晓军,畅志坚,阎晓涛,等.2个抗白粉病小偃麦异附加系的GISH鉴定[J].山西农业科学,2011,39(2):103-105.

[9]石丁溧,傅体华.抗白粉病小麦-中间偃麦草染色体小片段易位系的选育与鉴定[J].植物病理学报,2008,38(3):298-303.

郑瑗,李欣,贾举庆,郭慧娟,雷梦林,张树伟,常利芳,畅志坚,乔麟轶,陈芳,张晓军.抗条锈病小偃麦附加系CH366的FISH鉴定[J].山西农业科学,2021,49(03):278-280+284.