灵芝是一种珍贵的食药用真菌[1,2,3]，在过去的两千年里，一直被作为传统药物用于治疗和预防各种疾病。灵芝三萜是灵芝的重要生物活性产物之一，具有保肝、抗肿瘤、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抗氧化、降低血糖等作用[4,5,6,7,8,9,10]。数十年来，由于灵芝三萜的市场需求巨大，提高灵芝三萜的产量一直是生产者的主要目标。目前获取灵芝三萜的途径有两种，一种是从子实体或孢子粉中获得，另一种是从灵芝发酵液或菌丝体中获得[11,12]。通过栽培的方式获取灵芝三萜是现在的主要方法，但因生产周期较长，且三萜质量的稳定性容易受环境和气候的影响，严重影响灵芝产品的开发。通过液态深层发酵技术生产灵芝三萜，具有周期短、不受环境和气候的影响，且发酵条件易于控制等特点，从而成为更高效的获取灵芝三萜的方法[13]。

灵芝深层发酵的影响因素主要包括温度、通气量、转速和pH等。通常，灵芝的发酵温度为22～35℃，温度过高或过低均不利于菌丝体生长[14]。李平作等[15]研究发现，采用25L发酵罐、温度为30℃时，灵芝发酵合成灵芝酸的产量达到最大，为0.36g·L-1。灵芝发酵过程需要消耗氧气，而通气量的大小对溶氧浓度至关重要。冯杰等[16]优化了5L发酵罐中灵芝合成灵芝三萜的培养条件，通气量为8L·min-1时，三萜得率和生产强度最高，分别达到了0.204g·L-1和0.00131g·（L·h)-1。发酵过程中转速的大小会影响菌丝体形态和代谢产物的合成。FENG等[17]开发了一种简单且可重现的两阶段转速控制策略增加灵芝发酵三萜的产量，在0～40h，将搅拌速度控制在150r·min-1，随后将搅拌速度控制在100r·min-1，三萜的最大浓度达到0.086g·L-1，比对照组提高了39.61%。与此同时微生物的生长、发育及代谢产物的合成需要在合适的pH条件下进行[18]。pH不仅可以改变细胞形态和培养液的流变性，而且还可以影响细胞生长和代谢产物的产生[19]。现阶段发酵过程中的pH控制主要有4种方法，包括调整发酵培养基的组成、加入pH缓冲物质、补加碳源或氮源、补加酸或碱。改变发酵培养基仅限于控制发酵初期的pH条件[20]，而加入pH缓冲物质和补加碳氮源对pH的调节能力有限。通过发酵罐补加酸碱液的方式可以维持整个发酵环境在一个稳定的pH条件下，同时监控发酵过程参数的变化和发酵全程连续的代谢情况，从而探求pH条件对灵芝发酵影响的内在规律。pH对灵芝液态深层发酵有很大的影响，李平作等[21]发现灵芝液态深层发酵的起始pH为5.5时，有利于胞外多糖的合成，而在发酵过程中控制pH为4.0时，胞外多糖的产量最大，达到2.32g·L-1，较未控制提高了24%。KIM等[22]在灵芝液态深层发酵过程中发现灵芝菌丝体生长和胞外多糖合成的最适pH条件不同，并采用两阶段pH控制策略发酵，得到最大菌丝体干重12.5g·L-1和最高胞外多糖含量4.7g·L-1。可见，在发酵过程中采用pH控制策略可以促进发酵产物的积累。笔者采用3L发酵罐，以酸碱液补料的方式来研究灵芝液态深层发酵过程中pH调控对合成灵芝胞内三萜的影响，通过pH阶段控制来提高灵芝合成三萜的产量，为规模化深层发酵生产灵芝三萜提供科学依据。

1、材料与方法

1.1菌株

灵芝（G.lucidum）菌株由上海市农业科学院食用菌研究所提供和保藏，菌株编号：longzhino.2。

1.2仪器与设备

ZWY-2102双层恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；BIOTECH-3BG-9000D3L发酵罐、BIOTECH-5BGZ-50JS50L发酵罐（上海保兴生物设备工程有限公司）；SynergyHT多功能酶标仪（美国BioTek公司）。

1.3培养基

平板培养基：称取39gPDA粉末溶于1000mL蒸馏水。种子培养基：30g·L-1葡萄糖、2g·L-1酵母粉、1.5g·L-1磷酸二氢钾、1.5g·L-1七水合硫酸镁。发酵培养基：30g·L-1葡萄糖、3g·L-1酵母粉、2g·L-1磷酸二氢钾、2g·L-1七水合硫酸镁。

1.4培养条件

种子液培养：挑取冷冻管保藏的菌种于平板培养基中，26℃培养12d后，取3块约0.2cm2的菌块接于装有100mL种子培养基的250mL三角瓶中，于26℃、150r·min-1培养10d得一级种子液。将一级种子液以10%(V∶V）的接种量接种于装有200mL种子培养基的500mL三角瓶中，于26℃、150r·min-1培养7d得二级种子液。

发酵罐培养：将二级种子液以10%(V∶V）的接种量接种于含有2L发酵培养基的3L发酵罐中，在通气量为150L·h-1、温度26℃、搅拌速度100r·min-1条件下培养168h。在发酵罐培养过程中通过补料盐酸（2moL·L-1）和氢氧化钠（2moL·L-1），控制发酵液pH分别为3.5、4.0、4.5、5.0和5.5，对照组pH自然。

1.5菌丝体干重、还原糖含量和灵芝胞内三萜含量测定

在培养的0、24、72、120、168h分别取50mL发酵醪，9803g离心10min，沉淀用去离子水洗涤3次，在60℃烘箱中烘干至质量恒定，精确测定质量[23]，记录菌丝体干重。取离心后的上清液，用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖含量[24]。干燥的菌丝体用95%乙醇，料液比1∶50(g∶mL）浸提24h，以齐墩果酸为标准品，采用香草醛-冰醋酸比色法测定灵芝胞内三萜含量[25,26]。每组实验设定3个平行，计算平均值。

1.6动力学参数的计算

用Origin2017软件对实验数据进行拟合，并插值计算不同pH条件下的菌丝体比生长速率、还原糖比消耗速率和灵芝胞内三萜比合成速率[27]。菌丝体比生长速率（μ）、还原糖比消耗速率（qs）和灵芝胞内三萜比合成速率（qp）分别根据以下公式计算。

其中Cx为菌丝体干重，Cs为还原糖消耗质量浓度，Cp为灵芝胞内三萜含量，t为发酵时间。

1.7多阶段pH控制策略的优化及验证

根据不同pH条件下灵芝菌丝体比生长速率和灵芝胞内三萜比合成速率的变化，优化发酵过程中的pH条件，设计多阶段pH控制策略，并分别在3L和50L发酵罐（装液量40L）中验证。

2、结果与分析

2.1pH对灵芝液态深层发酵过程中菌丝体生长的影响

微生物的生长代谢过程非常复杂，而pH对此影响很大[28,29]。由图1可知，在不同pH条件下，菌丝体生长的迟滞期在0～24h，在24h后进入对数生长期。在对照、pH3.5、pH4.0和pH5.5条件下，72h后菌丝体生长进入稳定期；而在pH4.5和5.0条件下，菌丝体的对数生长期较长，在120h后才进入稳定期。在pH4.5的条件下，发酵得到的菌丝体干重最大，为12.31g·L-1，比对照提高38.16%。比生长速率是指每小时单位质量的菌丝体所增加的菌丝体量。它是表征微生物生长速率的参数，也是发酵动力学中的重要参数。比生长速率值越大，表明菌丝体的生长活力越大。在0～26h，对照的菌丝体比生长速率最高；26～36h,pH4.0的菌丝体比生长速率最高；36～49h,pH4.5的菌丝体比生长速率最高；49h之后pH5.0的菌丝体比生长速率最高。

图1不同pH条件对灵芝菌丝体生长的影响

2.2pH对灵芝液态深层发酵过程中还原糖含量的影响

不同pH对菌丝体消耗还原糖有较大的影响。由图2可知，随着菌丝体的生长，还原糖的消耗量也逐渐增加。在pH4.5条件下，还原糖消耗速率最快，初始还原糖浓度为30g·L-1，还原糖的最终浓度为7.15g·L-1，利用率为76.17%，利用率与对照相比提高了21.73%。比消耗速率是指相对单位质量细胞单位时间内的基质消耗量。比消耗速率反映的是菌丝体对底物利用的快慢。由图2b可知，pH4.5条件下还原糖的最大比消耗速率最低，而在pH4.5的条件下，发酵得到的菌丝体干重最大，说明在此pH条件下菌丝体对还原糖的利用速率虽然最慢，但利用率最高，同时产生的菌丝体干重最高。

2.3pH对灵芝液态深层发酵过程中灵芝胞内三萜合成的影响

由图1a和图3a可见，液态深层发酵过程中灵芝胞内三萜的积累与菌丝体的生长属于部分生长偶联型。在菌丝体处于对数生长期时，灵芝胞内三萜的合成能够较快积累；当菌丝体生长开始进入稳定期时，菌丝体干重增长减慢，但灵芝胞内三萜的合成仍在较快地积累。在pH4.5条件下，灵芝胞内三萜含量最大，达到237.91mg·L-1，比对照提高了25.69%。而由图3b可知，在0～36h,pH4.0的灵芝胞内三萜比合成速率最快；36～81h,pH4.5的灵芝胞内三萜比合成速率最快；81～168h,pH5.0的灵芝胞内三萜比合成速率最快。

图2不同pH条件对还原糖消耗量的影响

图3不同pH条件对灵芝胞内三萜合成的影响

2.4灵芝液态深层发酵合成灵芝胞内三萜的pH控制策略优化

图4灵芝液态深层发酵的四阶段pH控制策略

结合图1和图3可知，pH4.5是菌丝体生长和灵芝胞内三萜合成的最佳条件，但在此条件下菌丝体比生长速率和灵芝胞内三萜比合成速率却不是最佳。在保证菌丝体尽可能快速生长的同时也能够大量的积累灵芝胞内三萜，这对灵芝胞内三萜生产效率的进一步提高是很有必要的。综合图1b和图3b，笔者提出以下方案：在发酵前期保证菌丝体能够快速生长，快速进入对数生长期，且在对数生长期能够维持较长的时间；在发酵后期则确保灵芝胞内三萜合成的最大比速率能够维持在最高值，这更有利于灵芝胞内三萜的积累。由图1b得出发酵在0～26h和26～36h两个时间段灵芝菌丝体比生长速率最高的pH条件分别为pH自然和pH4.0；而由图3b得出在36～81h和81～168h两个时间段灵芝胞内三萜比合成速率最快的pH条件分别为pH4.5和pH5.0。综合上述分析结果，得出灵芝菌丝体液态深层发酵过程的四阶段pH控制策略，如图4所示，0～26hpH自然；26～36h控制pH为4.0;36～81h控制pH为4.5;81～168h控制pH为5.0。

2.5四阶段pH控制对灵芝液态深层发酵合成灵芝胞内三萜的影响

利用上述策略分别在3L和50L发酵罐上进行验证，发酵过程中菌丝体干重、还原糖含量和灵芝胞内三萜含量的变化见图5。由表1可知，利用3L发酵罐通过四阶段pH控制策略发酵得到的菌丝体干重和灵芝胞内三萜含量分别为14.18g·L-1和279.59mg·L-1，分别比对照提高了59.15%和47.72%，比pH4.5条件下提高了15.19%和17.52%；将此策略用于50L发酵罐进行发酵，得到的菌丝体干重和灵芝胞内三萜含量分别为13.54g·L-1和256.97mg·L-1。

图5四阶段pH控制灵芝菌丝体液态深层发酵过程曲线

表1不同pH条件下灵芝液态深层发酵参数

3、讨论

pH对灵芝液态深层发酵的菌丝体生长和胞内三萜产量有很大的影响[22]。在灵芝发酵过程中会生成酸性或碱性代谢产物[23]，使发酵液的pH发生变化，因此仅仅通过改变初始发酵液的pH或添加酸碱缓冲溶液不能抵消在发酵过程中代谢产物对发酵液pH的影响。而通过发酵罐中的pH电极连续测定pH的变化，结合酸碱液自动补料的方式可以灵活精确的控制发酵液的pH，可用于研究不同阶段不同pH对灵芝液态深层发酵的影响。

FANG等[30]在摇瓶中研究了初始pH对灵芝发酵生产灵芝酸的影响，并通过控制发酵液初始pH为6.5使灵芝酸含量达到207.9mg·L-1。凌庆枝等[31]研究发现菌丝体生长及胞内灵芝酸生成的最适pH为5.5，胞外灵芝酸产生的最适pH为4.5，并采用优化的pH控制条件生产灵芝酸，胞外灵芝酸和胞内灵芝酸的产量分别提高至0.86g·L-1和0.364g·kg-1湿菌丝体；TANG等[18]通过结合pH和溶氧条件进行阶段控制发酵，使灵芝三萜的产量达到754.6mg·L-1;WANG等[32]通过添加药用昆虫神农蜣螂的乙醚提取物结合两阶段pH控制的策略使灵芝发酵三萜的产量达到了449.37mg·L-1。上述研究都提高了灵芝三萜的产量，但是一部分研究在摇瓶中进行，且研究局限于调节培养基的初始pH条件，而不是整个过程中的pH条件；另一部分研究虽然考虑了灵芝发酵整个过程中的pH条件，却在制定pH控制策略时，仅根据不同pH条件下灵芝发酵的三萜含量来确定，得到的pH控制策略不能最大程度的通过pH控制来提高灵芝胞内三萜的产量，而本实验的四阶段pH控制策略综合考虑了灵芝菌丝体的比生长速率和灵芝胞内三萜的比合成速率，在发酵前期保证菌丝体快速生长，在发酵后期使胞内三萜的比合成速率维持在最高值，这对于灵芝三萜的规模化生产有重要价值。本研究仅通过pH阶段控制提升灵芝深层发酵合成三萜的产量，而灵芝深层发酵的影响因素还包括温度、通气量和转速等，如果能在pH阶段控制发酵的基础上结合其他影响因素，得出的发酵控制策略对于提高灵芝胞内三萜产量会有更大的帮助。灵芝菌丝体生长阶段和代谢产物生成阶段的最适pH不同，在灵芝发酵前期pH在4.0至4.5之间更有利于灵芝菌丝体生长，而在灵芝菌丝体生长到一定程度后提高发酵液pH至5.0则更有利于灵芝胞内三萜的产生，据此提出了灵芝菌丝体液态深层发酵过程的四阶段pH控制策略。通过监测发酵液中还原糖的含量可以监控发酵过程中底物利用的变化，不同pH条件下还原糖利用率存在较大的差别，本研究在pH多阶段优化策略中只关注了灵芝菌丝体生长和灵芝胞内三萜合成两个因素，而未将底物利用率加以考察，若进一步结合底物利用率的影响，则可推导出另外的发酵调控策略。目前已有研究发现灵芝酸是在角鲨烯合酶、角鲨烯环氧化酶、氧化鲨烯环氧化酶、细胞色素P450酶、甲基转移酶和乙酰基转移酶等催化作用下生成的最终产物[33,34]；而pH是影响酶催化反应速率的重要因素之一[35]。影响灵芝三萜合成的各种酶分子上有许多酸性和碱性的氨基酸侧链基团，如果酶要表现其活性，则这些基团必须有一定的解离形式。因而在发酵过程中调控pH的变化，使具有催化活性的特殊的离子基团在总酶中所占的比例提升，酶具有的催化灵芝三萜合成的能力也会有较大的提高。

本研究采用3L发酵罐，通过发酵罐的酸碱液补料装置进行pH调控，研究灵芝发酵的pH调控策略，并通过50L发酵罐进行放大验证。采用四阶段pH控制策略进行灵芝液态深层发酵能有效地提高灵芝胞内三萜的产量，该pH控制策略具有重要的工业应用价值，可以为灵芝菌丝体液态深层发酵的代谢和优化控制研究提供参考。

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基金:国家自然科学基金青年基金(31801919);上海市农业科学院学科领域建设专项[农科国推2019(匹配-12)];上海人才发展资金资助项目(2019052).