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VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1Ty-3对TYLCV的抗性

  2021-09-28    19  上传者:管理员

摘要:番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)严重威胁茄科蔬菜作物的生产。抗性标记Ty-1和Ty-3是一对等位基因,在番茄抗TYLCV育种中应用较为广泛。为了探究Ty-1/Ty-3抗病毒分子机制,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性标记的番茄Y19为材料,利用病毒诱导基因沉默(VIGS)技术,沉默RNA干扰(RNAi)机制关键基因,即番茄核糖核酸内切酶编码基因2a/b/c/d(SlDCL2)和番茄核糖核酸内切酶编码基因4(SlDCL4),初步分析其在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能。PCR与测序结果发现SlDCL2、SlDCL4的VIGS沉默载体pTRV2∶SlDCL2和pTRV2∶SlDCL4构建成功。以沉默番茄八氢番茄红素脱氢酶(SlPDS)基因为标记植株,定量PCR检测SlDCL2、SlDCL4沉默株系中SlDCL2、SlDCL4基因的沉默效率,结果显示SlDCL2、SlDCL4沉默株系中对应基因的表达均小于对照植株的50%,表明SlDCL2、SlDCL4沉默载体确实可以降低对应基因的表达,且不影响其他DCL基因的表达。VIGS沉默植株SlDCL2、SlDCL4基因后接种TYLCV,接种TYLCV30dpi结果显示,Y9材料表现出明显的TYLCV病毒症状,通过比较植株发病严重度发现,SlDCL2、SlDCL4沉默株系发病严重度分别为1.97、2.35,显著高于空载体注射株系(0.14)和对照株系(0.07)。本研究结果表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中发挥着重要作用,这为利用Ty-1/3抗性标记基因育种奠定了基础。

  • 关键词:
  • SlDCL2
  • SlDCL4
  • 基因沉默
  • 抗性
  • 番茄黄化曲叶病毒
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番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属,严重威胁番茄等茄科作物的安全生产[1]TYLCV主要通过粉虱咬食传播病毒[2,3,4]。该病毒基因组属于单链DNA,易发生变异。最先报道于1959年以色列约旦河谷,于1964年被正式命名为Tomatoyellowleafcurlvirus,2000年前后传入我国,2009年在我国番茄主产区大面积爆发。

目前栽培番茄中不含有抗TYLCV基因,所有抗TYLCV品种抗性基因均来源于野生番茄材料[5]。已报道的抗TYLCV标记基因包括Ty-1Ty-2Ty-3Ty-4Ty-5Ty-6,其中Ty-2来源于多毛番茄,Ty-1Ty-3Ty-4Ty-6来源于智力番茄,Ty-5来源于秘鲁番茄。其中Ty-1Ty-3是一对等位基因,在番茄抗病育种中应用较广[7,8,11,12,13,14]Ty-1/Ty-3编码RNA依赖型RNA聚合酶,Ty-1/Ty-3如何抵抗病毒仍有待研究。

植物抗病毒复制主要通过RNA干扰,参与RNAi机制的蛋白主要有三类,核糖核酸内切酶类蛋白、AGORDRRNAi过程可分为三个阶段:1)DCL将双链RNA剪切加工成2124nt的小干扰RNA;2)RDRsiRNA重新反转录成dsRNA,新合成的dsRNA再次经过DCL剪切形成更多的次级siRNA;3)AGOsiRNA结合形成RNA诱导沉默复合体,RISC通过碱基互补配对的方式结合与siRNA匹配的靶标基因或病毒序列,并将其进行降解,上述三个阶段中第一阶段至关重要[15]。目前已有研究表明,拟南芥中的DCL2(AtDCL2)DCL4(AtDCL4)在抗病毒中发挥重要作用,在拟南芥DCL2DCL4突变体dcl2dcl4中,病毒大量累积[16],由此可知DCLRNAi过程的第一阶段中发挥重要作用[17]

番茄中已经鉴定出的DCL基因有7个,分别为SlDCL1SlDCL2a/b/c/d(SlDCL2)SlDCL3SlDCL4[18],其中SlDCL2SlDCL4分别与拟南芥AtDCL2AtDCL4同源,推测其功能相似。为了明确番茄SlDCL2SlDCL4Ty-1/Ty-3TYLCV中的作用,本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性基因的Y9番茄为材料,通过病毒诱导基因沉默技术,分析番茄RNAi通路关键基因SlDCL2SlDCL4Ty-1/Ty-3介导的抗TYLCV中的功能,旨在为番茄应用Ty-1/Ty-3抗病育种奠定基础。


1、材料与方法


1.1试验材料

试验所用番茄材料Y19来自西北农林科技大学园艺学院番茄种质创新实验室;TRV1TRV2载体来自耶鲁大学Dr.Dinesh-Kumar实验室;TRV2SlPDS来自西北农林科技大学植物保护学院刘同先实验室;大肠杆菌DH5α及农杆菌GV3101来自贵州大学植物病理实验室;TYLCV侵染性克隆引自中国农业大学植物保护学院周涛实验室。KpnⅠ、XbaⅠ限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司,Taq聚合酶、反转录试剂盒、SYBRMastermix(2×)购自南京诺维赞生物科技有限公司,RNA提取试剂(TRIzol)、卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮等购自上海生工生物工程(中国)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1VIGS载体构建

Y19生长点幼叶片为材料,利用TRIzol法提取总RNA,去除DNA后,反转录成cDNA,存于-80℃备用。从https://solgenomics.net/网站获取番茄SlDCL2a/b/c/dSlDCL4的基因序列,利用VIGS-tool在线软件筛选SlDCL2a/b/c/dSlDCL4的特异性片段SlDCL2SlDCL4,PrimerPremier5.0设计特异性引物,根据VIGS载体添加酶切位点(1),扩增SlDCL2SlDCL4基因片段。将扩增的SlDCL2SlDCL4靶标基因片段胶回收试剂盒回收后,连接于pMD-18T载体,并转化至大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中,涂布于含卡那霉素的LB固体平板进行生长,通过PCR鉴定挑选阳性克隆提取质粒,测序成功后,用KpnIXbaI双酶切pMD-18T-SlDCL2pMD-18T-SlDCL4pTRV2载体。胶回收SlDCL2片段、SlDCL4片段、TRV2的双酶切产物,将SlDCL2片段、SlDCL4片段分别与TRV2双酶切产物用T4连接酶(上海生工)连接,16℃连接过夜,将连接产物转化至大肠杆菌(DH5α)后进行菌落PCR,挑选阳性克隆并提取重组质粒,酶切验证重组质粒连接正确后,通过冻融法转入农杆菌(GV3101)中,加入30%灭菌甘油储藏于-80℃备用。

1.2.2VIGS沉默接种方法

分别将含有TRV1TRV2-SlDCL2TRV2-SlDCL4TRV2SlPDS重组质粒的农杆菌,在含利福平(Rif)25mg·L-1、卡那霉素(Kan)50mg·L-1、庆大霉素(Gen)50mg·L-1LB固体培养基中活化,然后挑取单菌落在液体LB培养基(25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan+50mg·L-1Gen)中培养3648h(OD600=0.81.0),低速离心(5000r·min-1)5min,弃上清,诱导培养基[10.5g·L-1K2HPO4+4.5g·L-1KH2PO4+10.5g·L-1(NH4)2SO4+10.5g·L-1柠檬酸钠+1.0mmol·L-1MgSO4+0.2%(w/v)葡萄糖+0.5%(v/v)+10mmol·L-1吗啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonicacid,MES)+50μmol·L-1乙酰丁香酮]重新悬浮,调制OD600=0.81.0,将含有TRV1农杆菌分别与含有TRV2-SlDCL2TRV2-SlDCL4TRV2-SlPDS农杆菌按照11进行混合,室温放置3h,通过1.0mL注射器接种植株叶片,每个植株接种3次,每次接种1mL[19],将含有TRV空载体的农杆菌接种植株(TRV00)和接种农杆菌的植株(对照)分别作为对照。

1.2.3沉默效率检测

通过实时定量PCR技术分析SlDCL2SlDCL4沉默效率[20,21],VIGS接种后采集生长点叶片0.1g,TRIzol提取总RNA,DNA(DNase)祛除DNA后反转录成cDNA,SlDCL2SlDCL4定量引物qSlDCL2-F/RqSlDCL4-F/R见表1,将β-Actin作为内参基因[21],使用CFX96TMReal-TimeSystem荧光定量PCR(美国BIO-RAD公司)进行定量检测。反应程序为:95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火15s,40个循环;95℃变性10s,65℃退火10s,95℃延伸5s;反应体系20μL,每个处理1520株,采集样品随机选至少3株。

1.2.4Y19TYLCV标记基因Ty-1/Ty-3检测

提取Y19番茄幼苗总DNA,Ty-1/Ty-3引物[22]如表1,PCR反应条件:95℃预变性4min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环;72℃延伸10min;反应体系通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测拍照。

1.2.5TYLCV病毒接种

VIGS沉默接种14d后,用TYLCV侵染性克隆接种病毒[23],接种方法参考Li[24],将活化后的农杆菌GV3101(TYLCV-SH2)接种于番茄植株的地上部10cm处的韧皮部,同时以接种GV3101(空载体)的植株作为对照。观察发病情况并通过PCR检测TYLCV是否接种成功[18],每个处理1520株,随机取样,每个处理至少取3株。

1.2.6TYLCV病毒含量检测

TYLCV含量检测通过定量PCRqPCR[25]ELISA试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)检测。qPCR:TYLCV病毒DNA提取采用CTAB法,TYLCV-F/R定量引物见表1,β-Actin作为内参基因,采用CFX96TMReal-TimeSystem荧光定量PCR仪进行。qPCR反应程序为:95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火15s,40个循环;95℃变性10s,65℃退火10s,95℃延伸5s;反应体系为20μL,3个生物学重复。ELISA试剂盒检测按照说明书进行操作。


2、结果与分析


2.1VIGS载体的构建与鉴定

通过比较番茄SlDCL基因家族氨基酸序列与核酸序列,选取特异性片段作为DCL2DCL4基因靶标片段,设计引物并扩增特异性片段后,将靶标片段分别连接pMD-18T载体,经过测序发现靶标片段与目标基因核酸序列99%相似,确定为目标靶标片段。经KpnIXbaI双酶切验证后,将目标靶标片段插入到pTRV2载体中,获得pTRV2-SlDCL2pTRV2-SlDCL4(1),分别将pTRV1pTRV2-SlDCL2pTRV2-SlDCL4转化至农杆菌GV3101,经菌液PCR验证后,70%菌液加30%甘油保存于-80℃冰箱备用。

2.2TRV2SlDCL2TRVSlDCL4沉默效率统计

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素合成途径中的重要限速酶,VIGS沉默番茄PDS(SlPDS)植株2周开始出现白化现象,且可以持续到开花结果(2)VIGS接种4周,对照TRVSlPDS全部表现白化,可推测TRV2SlDCL2TRV2SlDCL4同样沉默。通过qRT-PCR检测SlDCL2SlDCL4的沉默效率,得到SlDCL2相对表达量小于0.5,此时SlDCL2沉默效率大于50%;同样,SlDCL4相对表达小于0.5,SlDCL4沉默效率大于50%。因此TRV2SlDCL2TRV2SlDCL4可以用于后续研究。

2.3Ty-1/Ty-3抗性标记检测

通过Ty-1/Ty-3特异性引物检测,本试验所用材料Y19携带有Ty-1/Ty-3抗性标记(3),田间观察,Y19TYLCV具有抗性。

2.4SlDCL2SlDCL4基因沉默对Ty-1/Ty-3抗性的影响

为了探究SlDCL2SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3TYLCV中的作用,本研究通过VIGS技术分别共沉默SlDCL2SlDCL4。如图4所示,4个处理分别为对照、TRV200TRV2SlDCL2TRV2SlDCL4,4个处理中,TRV2SlDCL2TRV2SlDCL4在接种TYLCV2个星期,开始出现典型的TYLCV病毒症状,而对植株对照与TRV200空载体植株也未出现TYLCV病毒症状。TYLCV接种4星期后,检测不同处理植株病毒含量,并统计植株发病严重度,结果显示TRV2SlDCL2TRV2SlDCL4病毒含量、发病严重度显著高于对照和空载体(TRV200)。结果表明,沉默SlDCL2SlDCL4后,携带Ty-1/Ty-3抗性基因Y9番茄材料的抗性被破坏。


3、讨论


本研究通过VIGS沉默技术研究番茄RNAi通路关键基因SlDCL2SlDCL4Ty-1/Ty-3TYLCV中的功能,结果显示,沉默SlDCL2SlDCL4后,Y19植株表现出感病症状,暗示SlDCL2SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3TYLCV中至关重要。Verlaan[12]发现Ty-1Ty-3是一对等位基因,编码RDR蛋白,而RDRDCLAGO蛋白共同参与RNAi机制。

DCL蛋白可以将dsRNA剪切成siRNA,RNAi通路中发挥关键作用。拟南芥中含有4DCL,分别是AtDCL1AtDCL2AtDCL3AtDCL4,AtDCL1参与剪切形成miRNA,AtDCL2AtDCL4在拟南芥抗病毒中发挥重要作用,Deleris[16]发现拟南芥AtDCL2AtDCL4突变加重植株的病毒症状。目前番茄中鉴定了7SlDCL蛋白,其中SlDCL2含有4个亚型,SlDCL2aSlDCL2bSlDCL2cSlDCL2d,其氨基酸序列同源性高达81%,推断其可能是同一个基因在染色体上的不同拷贝[18]。本研究所用技术为VIGS沉默技术,所选靶标片段大小一般要求200400bp,由于通过VIGS技术不能分别单独沉默4SlDCL2亚型,因此本试验沉默靶标片段为4SlDCL2亚型的保守区域,结果显示为SlDCL2基因4个亚型共沉默表型。但基因编辑技术所用的靶标片段一般仅为2122bp,因此可以将高同源性基因家族进行单独敲除,如Wang[26]通过基因编辑技术突变SlDCL2a/b,发现SlDCL2a/b在番茄抗烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)和土豆X病毒(potatovirusX,PVX)中发挥重要作用。因为RNAi技术选择靶标基因片段也是200400bp,本研究不能将4SlDCL2亚型分别进行单独沉默,如Suzuki[27]同样是通过RNAi技术干扰SlDCL2/4表达,结果使该材料对马铃薯纺锤纤块茎类病毒(Potatospindletuberviroid)的抗性由耐性转变为致病或全身坏死。

Wang[26]通过基因编辑技术同时敲除SlDCL2a/b,发现SlDCL2a/b在番茄抗PVXTMV抗性途径中发挥关键作用,本研究发现SlDCL2在番茄抗DNA病毒-TYLCV中同样发挥重要作用,这也说明不同植物抵抗RNA病毒或DNA病毒可能存在相似的机制。

另外,SlDCL2对于内源性小RNAmicroRNA,miRNA至关重要,包括其他非典型miRNAs,miR6026[26]Wang[26]报道miR6026的产生需要SlDCL2,更重要的是miR6026可以将SlDCL2基因mRNA作为靶标,调控SlDCL2基因的表达,在将来的研究中,可以通过过表达miR6026来调控SlDCL2的含量。

SlDCL2a/b不仅影响病毒siRNA的合成,而且会影响miRNA的合成[26]。先前研究认为DCL2蛋白主要参与病毒siRNA合成[16],近几年,Wang[26]Suzuki[27]研究表明DCL蛋白同样参与调控内源miRNA合成,依赖于SlDCL2miRNA通路会影响番茄植株对RNA病毒的抗性。根据本研究结果沉默SlDCL2SlDCL4降低Ty-1/Ty-3抗病性,推测该通路同样参与调控植株对DNA病毒的抗性,有待进一步证明。

植物DCL除了参与抗病毒,还参与植物发育。Teng[28]发现玉米Dicer-like5(DCL5)缺失造成温敏型雄性不育的现象。关于DCL的研究不仅局限于植物,而且逐渐开始在致病微生物中进行,Yin[29]通过RNAi技术干扰柑橘青霉菌DCL2,结果显示柑橘青霉菌DCL2表达降低,其致病性随之降低,但DCL的功能还有待进一步研究。


4、结论


本研究通过VIGS技术沉默RNAi通路关键基因SlDCL2SlDCL4,番茄Y19材料中Ty-1/Ty-3TYLCV抗性降低,表明RNAi通路关键基因SlDCL2SlDCL4对于Ty-1/Ty-3抗性至关重要,同样可推测RNAi通路参与了番茄Ty-1/Ty-3TYLCV的过程。


文章来源:岳宁波,李玉龙,孙一凡,潘鹏程,潘寅涛,郑寅,李云洲,梁燕.VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性[J].核农学报,2021,35(11):2493-2500

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