番茄黄化曲叶病毒属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属,严重威胁番茄等茄科作物的安全生产[1]。TYLCV主要通过粉虱咬食传播病毒[2,3,4]。该病毒基因组属于单链DNA,易发生变异。最先报道于1959年以色列约旦河谷，于1964年被正式命名为Tomatoyellowleafcurlvirus,2000年前后传入我国，2009年在我国番茄主产区大面积爆发。

目前栽培番茄中不含有抗TYLCV基因，所有抗TYLCV品种抗性基因均来源于野生番茄材料[5]。已报道的抗TYLCV标记基因包括Ty-1、Ty-2、Ty-3、Ty-4、Ty-5和Ty-6,其中Ty-2来源于多毛番茄,Ty-1、Ty-3、Ty-4和Ty-6来源于智力番茄,Ty-5来源于秘鲁番茄。其中Ty-1和Ty-3是一对等位基因，在番茄抗病育种中应用较广[7,8,11,12,13,14]。Ty-1/Ty-3编码RNA依赖型RNA聚合酶,但Ty-1/Ty-3如何抵抗病毒仍有待研究。

植物抗病毒复制主要通过RNA干扰,参与RNAi机制的蛋白主要有三类，核糖核酸内切酶类蛋白、AGO、RDR。RNAi过程可分为三个阶段：1)DCL将双链RNA剪切加工成21～24nt的小干扰RNA;2)RDR将siRNA重新反转录成dsRNA,新合成的dsRNA再次经过DCL剪切形成更多的次级siRNA;3)AGO与siRNA结合形成RNA诱导沉默复合体,RISC通过碱基互补配对的方式结合与siRNA匹配的靶标基因或病毒序列，并将其进行降解，上述三个阶段中第一阶段至关重要[15]。目前已有研究表明，拟南芥中的DCL2(AtDCL2)和DCL4(AtDCL4)在抗病毒中发挥重要作用，在拟南芥DCL2、DCL4突变体dcl2、dcl4中，病毒大量累积[16],由此可知DCL在RNAi过程的第一阶段中发挥重要作用[17]。

番茄中已经鉴定出的DCL基因有7个，分别为SlDCL1、SlDCL2a/b/c/d(SlDCL2)、SlDCL3和SlDCL4[18],其中SlDCL2、SlDCL4分别与拟南芥AtDCL2和AtDCL4同源，推测其功能相似。为了明确番茄SlDCL2和SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的作用，本研究以携带Ty-1/Ty-3抗性基因的Y9番茄为材料，通过病毒诱导基因沉默技术，分析番茄RNAi通路关键基因SlDCL2和SlDCL4在Ty-1/Ty-3介导的抗TYLCV中的功能，旨在为番茄应用Ty-1/Ty-3抗病育种奠定基础。

1、材料与方法

1.1试验材料

试验所用番茄材料Y19来自西北农林科技大学园艺学院番茄种质创新实验室；TRV1、TRV2载体来自耶鲁大学Dr.Dinesh-Kumar实验室；TRV2∶SlPDS来自西北农林科技大学植物保护学院刘同先实验室；大肠杆菌DH5α及农杆菌GV3101来自贵州大学植物病理实验室；TYLCV侵染性克隆引自中国农业大学植物保护学院周涛实验室。KpnⅠ、XbaⅠ限制性内切酶购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，Taq聚合酶、反转录试剂盒、SYBRMastermix(2×)购自南京诺维赞生物科技有限公司，RNA提取试剂(TRIzol)、卡那霉素、利福平、乙酰丁香酮等购自上海生工生物工程(中国)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1VIGS载体构建

以Y19生长点幼叶片为材料，利用TRIzol法提取总RNA,去除DNA后，反转录成cDNA,存于-80℃备用。从https://solgenomics.net/网站获取番茄SlDCL2a/b/c/d、SlDCL4的基因序列，利用VIGS-tool在线软件筛选SlDCL2a/b/c/d、SlDCL4的特异性片段SlDCL2和SlDCL4,用PrimerPremier5.0设计特异性引物，根据VIGS载体添加酶切位点(表1),扩增SlDCL2和SlDCL4基因片段。将扩增的SlDCL2和SlDCL4靶标基因片段胶回收试剂盒回收后，连接于pMD-18T载体，并转化至大肠杆菌(DH5α)感受态细胞中，涂布于含卡那霉素的LB固体平板进行生长，通过PCR鉴定挑选阳性克隆提取质粒，测序成功后，用KpnI和XbaI双酶切pMD-18T-SlDCL2、pMD-18T-SlDCL4及pTRV2载体。胶回收SlDCL2片段、SlDCL4片段、TRV2的双酶切产物，将SlDCL2片段、SlDCL4片段分别与TRV2双酶切产物用T4连接酶(上海生工)连接，16℃连接过夜，将连接产物转化至大肠杆菌(DH5α)后进行菌落PCR,挑选阳性克隆并提取重组质粒，酶切验证重组质粒连接正确后，通过冻融法转入农杆菌(GV3101)中，加入30%灭菌甘油储藏于-80℃备用。

1.2.2VIGS沉默接种方法

分别将含有TRV1、TRV2-SlDCL2、TRV2-SlDCL4、TRV2∶SlPDS重组质粒的农杆菌，在含利福平(Rif)25mg·L-1、卡那霉素(Kan)50mg·L-1、庆大霉素(Gen)50mg·L-1的LB固体培养基中活化，然后挑取单菌落在液体LB培养基(25mg·L-1Rif+50mg·L-1Kan+50mg·L-1Gen)中培养36～48h(OD600=0.8～1.0),低速离心(5000r·min-1)5min,弃上清，诱导培养基[10.5g·L-1K2HPO4+4.5g·L-1KH2PO4+10.5g·L-1(NH4)2SO4+10.5g·L-1柠檬酸钠+1.0mmol·L-1MgSO4+0.2%(w/v)葡萄糖+0.5%(v/v)+10mmol·L-1吗啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonicacid,MES)+50μmol·L-1乙酰丁香酮]重新悬浮，调制OD600=0.8～1.0,将含有TRV1农杆菌分别与含有TRV2-SlDCL2、TRV2-SlDCL4、TRV2-SlPDS农杆菌按照1∶1进行混合，室温放置3h,通过1.0mL注射器接种植株叶片，每个植株接种3次，每次接种1mL[19],将含有TRV空载体的农杆菌接种植株(TRV∶00)和接种农杆菌的植株(对照)分别作为对照。

1.2.3沉默效率检测

通过实时定量PCR技术分析SlDCL2、SlDCL4沉默效率[20,21],VIGS接种后采集生长点叶片0.1g,TRIzol提取总RNA,DNA酶(DNase)祛除DNA后反转录成cDNA,SlDCL2和SlDCL4定量引物qSlDCL2-F/R、qSlDCL4-F/R见表1,将β-Actin作为内参基因[21],使用CFX96TMReal-TimeSystem荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)进行定量检测。反应程序为：95℃预变性5min;95℃变性15s,60℃退火15s,40个循环；95℃变性10s,65℃退火10s,95℃延伸5s;反应体系20μL,每个处理15～20株，采集样品随机选至少3株。

1.2.4Y19抗TYLCV标记基因Ty-1/Ty-3检测

提取Y19番茄幼苗总DNA,Ty-1/Ty-3引物[22]如表1,PCR反应条件：95℃预变性4min;95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸10min;反应体系通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测拍照。

1.2.5TYLCV病毒接种

VIGS沉默接种14d后，用TYLCV侵染性克隆接种病毒[23],接种方法参考Li等[24],将活化后的农杆菌GV3101(TYLCV-SH2)接种于番茄植株的地上部10cm处的韧皮部，同时以接种GV3101(空载体)的植株作为对照。观察发病情况并通过PCR检测TYLCV是否接种成功[18],每个处理15～20株，随机取样，每个处理至少取3株。

1.2.6TYLCV病毒含量检测

TYLCV含量检测通过定量PCRqPCR[25]和ELISA试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)检测。qPCR:TYLCV病毒DNA提取采用CTAB法，TYLCV-F/R定量引物见表1,β-Actin作为内参基因，采用CFX96TMReal-TimeSystem荧光定量PCR仪进行。qPCR反应程序为：95℃预变性10min;95℃变性15s,60℃退火15s,40个循环；95℃变性10s,65℃退火10s,95℃延伸5s;反应体系为20μL,设3个生物学重复。ELISA试剂盒检测按照说明书进行操作。

2、结果与分析

2.1VIGS载体的构建与鉴定

通过比较番茄SlDCL基因家族氨基酸序列与核酸序列，选取特异性片段作为DCL2、DCL4基因靶标片段，设计引物并扩增特异性片段后，将靶标片段分别连接pMD-18T载体，经过测序发现靶标片段与目标基因核酸序列99%相似，确定为目标靶标片段。经KpnI和XbaI双酶切验证后，将目标靶标片段插入到pTRV2载体中，获得pTRV2-SlDCL2、pTRV2-SlDCL4(图1),分别将pTRV1、pTRV2-SlDCL2、pTRV2-SlDCL4转化至农杆菌GV3101,经菌液PCR验证后，70%菌液加30%甘油保存于-80℃冰箱备用。

2.2TRV2∶SlDCL2、TRV∶SlDCL4沉默效率统计

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素合成途径中的重要限速酶，VIGS沉默番茄PDS(SlPDS)植株2周开始出现白化现象，且可以持续到开花结果(图2)。VIGS接种4周，对照TRV∶SlPDS全部表现白化，可推测TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4同样沉默。通过qRT-PCR检测SlDCL2、SlDCL4的沉默效率，得到SlDCL2相对表达量小于0.5,此时SlDCL2沉默效率大于50%;同样，SlDCL4相对表达小于0.5,SlDCL4沉默效率大于50%。因此TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4可以用于后续研究。

2.3Ty-1/Ty-3抗性标记检测

通过Ty-1/Ty-3特异性引物检测，本试验所用材料Y19携带有Ty-1/Ty-3抗性标记(图3),田间观察，Y19对TYLCV具有抗性。

2.4SlDCL2和SlDCL4基因沉默对Ty-1/Ty-3抗性的影响

为了探究SlDCL2、SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的作用，本研究通过VIGS技术分别共沉默SlDCL2或SlDCL4。如图4所示，4个处理分别为对照、TRV2∶00、TRV2∶SlDCL2、TRV2∶SlDCL4,4个处理中，TRV2∶SlDCL2和TRV2∶SlDCL4在接种TYLCV后2个星期，开始出现典型的TYLCV病毒症状，而对植株对照与TRV2∶00空载体植株也未出现TYLCV病毒症状。TYLCV接种4星期后，检测不同处理植株病毒含量，并统计植株发病严重度，结果显示TRV2∶SlDCL2和TRV2∶SlDCL4病毒含量、发病严重度显著高于对照和空载体(TRV2∶00)。结果表明，沉默SlDCL2或SlDCL4后，携带Ty-1/Ty-3抗性基因Y9番茄材料的抗性被破坏。

3、讨论

本研究通过VIGS沉默技术研究番茄RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4在Ty-1/Ty-3抗TYLCV中的功能，结果显示，沉默SlDCL2或SlDCL4后，Y19植株表现出感病症状，暗示SlDCL2、SlDCL4在番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV中至关重要。Verlaan等[12]发现Ty-1和Ty-3是一对等位基因，编码RDR蛋白，而RDR和DCL、AGO蛋白共同参与RNAi机制。

DCL蛋白可以将dsRNA剪切成siRNA,在RNAi通路中发挥关键作用。拟南芥中含有4个DCL,分别是AtDCL1、AtDCL2、AtDCL3和AtDCL4,AtDCL1参与剪切形成miRNA,而AtDCL2和AtDCL4在拟南芥抗病毒中发挥重要作用，Deleris等[16]发现拟南芥AtDCL2和AtDCL4突变加重植株的病毒症状。目前番茄中鉴定了7个SlDCL蛋白，其中SlDCL2含有4个亚型，SlDCL2a、SlDCL2b、SlDCL2c和SlDCL2d,其氨基酸序列同源性高达81%,推断其可能是同一个基因在染色体上的不同拷贝[18]。本研究所用技术为VIGS沉默技术，所选靶标片段大小一般要求200～400bp,由于通过VIGS技术不能分别单独沉默4个SlDCL2亚型，因此本试验沉默靶标片段为4个SlDCL2亚型的保守区域，结果显示为SlDCL2基因4个亚型共沉默表型。但基因编辑技术所用的靶标片段一般仅为21～22bp,因此可以将高同源性基因家族进行单独敲除，如Wang等[26]通过基因编辑技术突变SlDCL2a/b,发现SlDCL2a/b在番茄抗烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,TMV)和土豆X病毒(potatovirusX,PVX)中发挥重要作用。因为RNAi技术选择靶标基因片段也是200～400bp,本研究不能将4个SlDCL2亚型分别进行单独沉默，如Suzuki等[27]同样是通过RNAi技术干扰SlDCL2/4表达，结果使该材料对马铃薯纺锤纤块茎类病毒(Potatospindletuberviroid)的抗性由耐性转变为致病或全身坏死。

Wang等[26]通过基因编辑技术同时敲除SlDCL2a/b,发现SlDCL2a/b在番茄抗PVX和TMV抗性途径中发挥关键作用，本研究发现SlDCL2在番茄抗DNA病毒-TYLCV中同样发挥重要作用，这也说明不同植物抵抗RNA病毒或DNA病毒可能存在相似的机制。

另外，SlDCL2对于内源性小RNAmicroRNA,miRNA至关重要，包括其他非典型miRNAs,如miR6026[26]。Wang等[26]报道miR6026的产生需要SlDCL2,更重要的是miR6026可以将SlDCL2基因mRNA作为靶标，调控SlDCL2基因的表达，在将来的研究中，可以通过过表达miR6026来调控SlDCL2的含量。

SlDCL2a/b不仅影响病毒siRNA的合成，而且会影响miRNA的合成[26]。先前研究认为DCL2蛋白主要参与病毒siRNA合成[16],近几年，Wang等[26]和Suzuki等[27]研究表明DCL蛋白同样参与调控内源miRNA合成，依赖于SlDCL2的miRNA通路会影响番茄植株对RNA病毒的抗性。根据本研究结果沉默SlDCL2和SlDCL4降低Ty-1/Ty-3抗病性，推测该通路同样参与调控植株对DNA病毒的抗性，有待进一步证明。

植物DCL除了参与抗病毒，还参与植物发育。Teng等[28]发现玉米Dicer-like5(DCL5)缺失造成温敏型雄性不育的现象。关于DCL的研究不仅局限于植物，而且逐渐开始在致病微生物中进行，Yin等[29]通过RNAi技术干扰柑橘青霉菌DCL2,结果显示柑橘青霉菌DCL2表达降低，其致病性随之降低，但DCL的功能还有待进一步研究。

4、结论

本研究通过VIGS技术沉默RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4,番茄Y19材料中Ty-1/Ty-3对TYLCV抗性降低，表明RNAi通路关键基因SlDCL2、SlDCL4对于Ty-1/Ty-3抗性至关重要，同样可推测RNAi通路参与了番茄Ty-1/Ty-3抗TYLCV的过程。

文章来源：岳宁波,李玉龙,孙一凡,潘鹏程,潘寅涛,郑寅,李云洲,梁燕.VIGS沉默番茄SlDCL2和SlDCL4破坏Ty-1/Ty-3对TYLCV的抗性[J].核农学报,2021,35(11):2493-2500