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浅谈选育灰树花杂交菌株鲁灰86

2020-06-17 331 上传者：管理员

摘要：以灰树花野生菌株梯灰1号和栽培菌株庆灰151为亲本,各取10个孢子单核体单单杂交,采用光学显微镜观察是否存在锁状联合结构及通过与亲本的拮抗实验最终获得65个杂交子。选取23个菌丝生长速度较快的杂交子进行小试初筛栽培实验,并采用ISSR和SRAP分子标记对筛选出的优良杂交子构建系统发育树。结果表明:鲁灰86子实体颜色较深、朵型较大、菌管较短,产量分别比亲本梯灰1号和庆灰151提高了74.47%和20.53%,生物学转化率大于50%,且子实体中多糖含量较高;鲁灰86与两亲本间存在明显的遗传差异,是具有推广潜力的优质高产菌株。

关键词：
单单杂交
孢子单核体
灰树花
育种与栽培
食用菌
鲁灰86
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灰树花属于多孔菌目、皱孔菌科、树花菌属(Grifola),又名舞茸、栗蘑和林鸡,是珍稀食药用菌[1,2]。灰树花肉质脆嫩,味道鲜美,富含蛋白质、矿物质、多糖、甾醇和三萜等生物活性物质,具有抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、降血糖和降血脂等多种功能[3,4]。选育优良菌株一直是促进灰树花产业健康持续发展的重要基础。目前,最有效的育种手段是杂交育种,食用菌杂交育种包括单单杂交、双单杂交和多孢杂交[5]。张美彦等[6]对36个灰树花菌株进行了品比和筛选实验,筛选出原基形成率高、抗逆性好的两个菌株用于人工控制条件下生产。杨军等[7]在21.5～23.5℃从40株灰树花菌株中筛选出在该条件下两个正常开片出菇的菌株。刘振伟和史秀娟[8]采用多孢杂交技术成功培育出了两个优良菌株。笔者选择丰产、稳产的梯灰1号和子实体多糖含量高的庆灰151作为亲本进行孢子单核体的单单杂交,期望选育出具有优良性状的杂交子,为灰树花生产提供优质、高产的新菌株。

1、材料与方法

1.1亲本菌株

梯灰1号为野生菌株,2013年采集于山东省济南市梯子山栗树林下,经系统选育,适合在春秋季林下覆土栽培;庆灰151为浙江省庆元县主栽品种。

1.2培养基质和棉蓝染液

水琼脂培养基:20g琼脂,蒸馏水1L。

PDA加富固体培养基(g):200马铃薯、20葡萄糖、20琼脂、10麸皮、3蛋白胨、2酵母粉、1磷酸二氢钾、1无水硫酸镁,蒸馏水1L。

栽培培养料:42%棉籽壳、40%栗木屑、16%麸皮、1%赤砂糖、1%石膏,含水量为60%～65%,pH自然。

棉蓝染液:20g结晶苯酚、20mL乳酸、40mL甘油、0.05g棉蓝,20mL蒸馏水。

1.3单孢分离

从山东省农业科学院农业资源与环境研究所中试菇房中,分别采摘七成熟的亲本菌株梯灰1号和庆灰151的子实体,切掉菌柄,将菌盖切成1cm×2cm小块,摆放在无菌的直径为9cm培养皿盖中央半径2cm的同心圆内,菌管管口朝上,倒入45℃左右的水琼脂培养基,冷却固定菌盖,盖上培养皿盖,封口膜封口,培养皿正置,25℃避光放置24h,待担孢子弹射到培养皿底,用无菌水洗下担孢子并稀释成每毫升100个的孢子悬液。取100μL孢子悬液涂布PDA加富培养基平板,25℃避光培养12d,挑取单菌落至PDA加富培养基试管斜面,25℃避光培养,待菌丝长满试管后挑取前端菌丝,用棉蓝染液染色,在光学显微镜下观察锁状联合结构,无该结构的为单核菌株。

1.4杂交和杂交子筛选

分别选取梯灰1号和庆灰151孢子单核菌株各10株,两两配对,共100个组合。分别将两个单核菌株接种于同一平板培养基中心,两个菌丝块间距1.5cm,25℃避光培养7d,挑取两菌落交叠处的菌丝体并转接,在光学显微镜下观察,有锁状联合结构的为杂交子。

采用拮抗实验进一步筛选杂交子。以直径9cm培养皿圆心为中心画十字,分别在十字线距圆心2cm处取4个点,接种不同的4个杂交子,平皿圆心处接种1个亲本菌株,25℃避光培养15d,筛选与两亲本发生明显拮抗作用的杂交子。

将杂交子斜面种转接于PDA加富培养基平板上,25℃避光培养14d,用直径5mm的打孔器制成菌丝块,将杂交子菌丝块接种于PDA加富培养基平板中央,25℃避光培养14d,采用十字交叉法[11]测量菌落半径,计算菌丝生长速度,观察菌丝生长势和菌落边缘整齐度。

1.5小试初筛

按照参考文献[9]的方法制备杂交子液体菌种并进行栽培管理。用18cm×35cm聚丙烯袋,每袋装湿料1.2～1.3kg,接种10mL液体菌种,每个杂交子接种10袋,3次重复。记录两个亲本梯灰1号、庆灰151和选取的23个菌丝生长速度较快的杂交子的菌丝满袋时间,观察新鲜子实体的颜色,测量子实体长、宽和高度,菌盖长、宽和厚度,菌柄长和宽度以及菌管长度,计算出菇率、产量和生物转化率,按照中华人民共和国农业行业标准NY/T1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定[10]测定子实体中的多糖含量。

生物转化率=子实体鲜重/g培养料干重/g×100%

1.6系统发育树构建

采用ISSR和SRAP分子标记构建梯灰1号、庆灰151和杂交子54、55、57、61、62、86、88共9个灰树花菌株的系统发育树。用10条ISSR和7对SRAP引物(表1)进行PCR扩增。基因组DNA提取、ISSR和SRAP反应体系和反应条件、聚类分析的方法均参考文献[11]。统计200～3000bp的电泳条带,有扩增条带的记为1,无扩增条带的记为0,形成矩阵。采用NTSYSpc2.10e进行ISSR和SRAP标记的综合聚类分析,构建系统发育树。

表1ISSR和SRAP标记的引物序列导出到EXCEL

2、结果与分析

2.1杂交子筛选

通过光学显微镜观察,初步鉴定出具有锁状联合结构的杂交子73个;进一步通过拮抗实验筛选,最终获得65个与亲本有明显拮抗作用的杂交子。65个杂交子在PDA加富培养基平板上菌丝生长速度较快的有杂交子32、63、64、65、66、68、69和88,菌丝生长势好的杂交子有2、64、68、69、82和83(表2)。除83和89的菌落边缘不整齐,其他63个杂交子的菌落边缘均较为整齐。

2.2小试初筛

杂交子中56、61、62、65、71、85、88的菌丝满袋时间较短,杂交子86的菌丝满袋时间比亲本梯灰1号长约2d,比亲本庆灰151短约1d;杂交子64、68、85、86的子实体长、宽和高度均大于两个亲本以及其他杂交子,朵型较大;杂交子62、66、87的子实体长、宽和高度较小,朵型较小;杂交子64、87的菌盖长、宽和厚度均大于亲本和其他杂交子;杂交子55、86的菌盖中等大小,较薄;杂交子50、60、64的菌柄比亲本和其他杂交子长,也比亲本和其他杂交子粗;杂交子86的菌柄最短,中等粗度;杂交子86的菌管长度比亲本短,但组间差异无统计学意义;杂交子86的每袋产量最高,且与两个亲本和其他杂交子间的差异具有统计学意义,其产量分别比梯灰1号和庆灰151提高了74.47%(P<0.01)和20.53%(P<0.01);杂交子86的生物转化率最高;杂交子52、64、65、86、87、88的子实体中多糖含量均较高,其中86中的最高,为(4.74±0.14)%,比亲本梯灰1号提高了33.52%(P<0.01),比亲本庆灰151提高了11.53%(表3)。杂交子55、56、57、61、62、63、64、67、69、71、85、86、88的出菇率均在90%以上,杂交子87的出菇率只有11.54%。结果表明杂交子86具有子实体颜色深、菌管短、产量高且子实体中多糖含量高等优良性状,将其命名为鲁灰86。

表2杂交子的菌丝生长速度及生长势

鲁灰86子实体朵型较大,分枝较多,重叠成覆瓦状,紧凑,子实体长14.60～21.00cm,宽11.10～18.00cm,高6.70～11.20cm;菌盖匙形至扇形,表面灰黑色,有放射状条纹,边缘薄呈波状,肉质,菌盖长26.49～34.42mm,宽18.99～25.25mm;菌肉白色,厚1.20～1.93mm;菌柄白色,粗短,长4.39～7.13mm,宽3.14～6.35mm;菌盖背面布满白色菌管,长0.50～0.96mm,管口多角形。产量高,1kg干料产鲜子实体500～600g,生物学转化率在50%以上,为51.53%;子实体中多糖含量较高,为(4.74±0.14)%。

表3小试初筛栽培实验中两个亲本及23个杂交子的农艺性状

2.3系统发育树

通过PCR扩增共获得163条多态性条带。由图1可知,9个灰树花菌株间的相似系数为0.56～0.82,相似系数为0.56时分为两个类群,亲本庆灰151单独聚为一个类群,亲本梯灰1号与7个杂交子聚为一个类群;相似系数为0.77时,鲁灰86与杂交子62聚在一个亚类群,杂交子54、55、57、61、88在相似系数0.68处聚为一个亚类群,其中,杂交子54和55亲缘关系较近;鲁灰86与杂交子62亲缘关系较近,与另外5个杂交子亲缘关系较远。在分子水平上鲁灰86在内的7个杂交子与两个亲本菌株间都有不同程度的遗传差异。

图1基于ISSR和SRAP分子标记构建的系统发育树

3、讨论

单单杂交育种方向明确、操作简便,因此是目前食用菌育种最常采用的方法[12]。通过选取遗传差异较大的野生菌株梯灰1号和庆元县主栽品种庆灰151为亲本单单杂交,小试初筛初步筛选出菌株鲁灰86,其产量为每袋291.30g,分别比亲本梯灰1号和庆灰151提高了74.47%和20.53%,生物转化率在50%以上,子实体中多糖含量分别比亲本菌株梯灰1号和庆灰151提高了33.52%和11.53%。

有研究表明,连续服用灰树花子实体粉12周可激活体内免疫系统,提高甲流H1N1、H3N2和乙流BX-51B三价流感疫苗的效力,同时改善头痛、肌肉痛、鼻塞、流涕、发热等多种普通感冒症状[13]。体外实验和临床研究表明,灰树花对艾滋病毒、乙肝病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒71均有明显的抑制作用[14,15,16,17],有望开发成为广谱抗病毒药物。预防流感病毒感染是一项重大的公共卫生挑战,需要新的、安全、有效的措施降低感染风险。灰树花因其独特的口感风味和高效的保健效果,将具有更广阔的市场前景。

本研究接下来还需要进一步扩大实验规模,进行复筛、中试和示范栽培,检测菌株的均一性和稳定性,以期为灰树花生产提供优良新品种。

参考文献：

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基金:山东省重点研发计划项目(2018GNC111015);山东省泰山产业领军人才工程高效生态农业创新类项目(LJNY201701);国家现代农业产业技术体系(CARS-20);山东省农业良种工程项目(2017LZN031);山东省农业科学院农业科技创新工程(CXGC2017A01);2017年度济宁市创新领军人才和山东省现代农业产业技术体系食用菌产业创新团队建设.