红花(Carthamu stinctorius L.)别名草红花、刺红花，为菊科红花属草本植物。具有活血通经、散瘀、止痛、降血压、降低胆固醇等功效(国家药典委员会,2015,中国医药科技出版社,pp.151)。红花是一种集药用、食用等多价值于一体的多用途植物。红花以其种子油中亚油酸含量超80%而被称为“亚油酸之王”。红花具有较强的抗旱、抗寒、抗盐碱等能力(王果平等,2010)。

近年来，关于转录因子的研究报道越来越多。转录因子与顺式元件作用从而调控相关基因表达的分子机理是研究基因在某些环境条件下发挥功能的重要内容(黎帮勇等,2015)。热激转录因子(heat stress transcription factors,Hsfs)是调控热激蛋白在逆境中表达的一类转录因子，他们在HSP基因启动时可以与其启动子区的HSE原件结合，从而调控热激蛋白的转录。HSFA9转录因子属于HsFs家族的一员，具有典型的HSF结构域可以激活shsps蛋白的表达，参与植物的抗逆过程。研究发现，在烟草中异位过表达向日葵种子中的HSFA9基因，可以激活叶片中原本低丰度的小分子量热激蛋白的转录，提高PSII的量子产率，保护PSI和PSII蛋白，保护光合膜，使转基因烟草具有抵抗极端干旱和氧化胁迫的能力，并推测HSFA9在向日葵种子发育过程中可能通过保护前质体从而保护种子抵御发育过程中的干燥脱水现象(Almoguera et al.,2012)。目前有研究发现，HSFA9的转录受RCF3和ABI3的正向调节，受IAA27的负向调节。同时研究发现ABI3可以通过直接与HSFA9的启动子相互作用从而调控HSFA9的表达(Kotak et al.,2007)。

近年来，全球温室效应加剧使植物生长发育遭受到不可逆转的危害。了解并研究耐旱植物的抗旱机制，通过分子手段及转基因技术来改良植物抗逆性状，使其具有较强的抵抗非生物胁迫能力显得至关重要。红花作为中国大宗药材，已有悠久的栽培历史。红花是具有较强抗旱性的物种之一，能够适应多种生物及非生物胁迫，研究其抵御热胁迫的分子机制具有重要意义。虽然热胁迫相关转录因子在其他植物中已有报道，但在具有较强抗逆性的药用植物红花中该研究尚处空白阶段。本课题组前期通过转录组测序技术在红花中鉴定到一个种子脱水期高表达的胁迫相关转录因子序列，预测其可能参与红花的抗逆响应。

本研究通过对红花热胁迫相关转录因子进行克隆及序列分析，利用荧光定量PCR来测定其在不同发育时期红花种子中和不同植物组织中表达情况。该研究对改良红花品质，探究其抗逆性具有重要意义。

1、结果与分析

1.1基因克隆

以样品总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，电泳结果显示在1 000～1 500 bp的位置上有清晰的条带(图1)。将该条带回收纯化后与载体pClone007进行连接，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB培养基上，37℃培养18 h。运用菌落PCR鉴定阳性克隆。随机挑取3个单独菌斑送往擎科测序(Tsingke,中国)。测序结果显示，目的片段大小1 326 bp，与电泳结果一致。

1.2 CtHSFA9蛋白的理化性质和跨膜结构分析

CtHSFA9基因全长1 326 bp，预测蛋白质相对分子质量50 413.04。该基因编码441个氨基酸，等电点为5.36。最丰富氨基酸为亮氨酸(Leu)，带正电残基64个，带负电残基75个。预计其在哺乳动物中的半衰期为30 h，在酵母中为20 h以上，在大肠杆菌中为10 h以上，红花CtHSFA9的不稳定指数为53.52，性质不稳定，脂肪指数为70.02。平均亲水性系数为-0.813，属于不稳定的亲水性蛋白。使用Prot Scale在线工具对红花CtHSFA9蛋白的疏水性和亲水性进行预测分析，精氨酸(Arg)具有最低分值-4.5，亲水性最强，异亮氨酸(Ile)具有最高分值4.5，疏水性最强。亲水氨基酸分布都比较均匀，并且数量大于疏水氨基酸(图2)。利用TMHMM在线工具对红花热激转录因子基因进行跨膜分析表明不含跨膜结构域，由此推断为可溶性蛋白。

图1红花Ct HSFA9基因克隆

图2 Ct HSFA9蛋白疏水性

1.3 CtHSFA9蛋白的二级、三级结构预测

使用SMART软件对CtHSFA9氨基酸序列的功能进行预测，发现在69～82,108～117有一段低复杂性区段(low-complexity region,LCR),133～226存在HSF结构域，登录号为SM00415，具有结合DNA启动转录的功能。254～299有一段保守的卷曲螺旋区域(Coiled coil region)。用Signal P3.0在线分析工具对红CtHSFA9氨基酸序列进行信号肽的可能性分析，结果表明CtHSFA9氨基酸序列无明显的信号肽剪切信号。利用Target P软件预测结果表明，红花CtHSFA9基因所编码蛋白不属于分泌蛋白，无叶绿体转运肽及线粒体定位肽。对CtHSFA9蛋白的二级结构进行预测发现，该蛋白中47.39%的氨基酸组成无规则卷曲，35.15%的氨基酸组成了α-螺旋，11.56%的氨基酸组成延伸链，仅有5.9%的氨基酸组成β-转角(图3)。并对该基因编码蛋白三级结构进行预测。结果与二级结构预测较一致，CtHSFA9蛋白主要由无规则卷曲和α-螺旋组成(图4)。

图3 Ct HSFA9蛋白的二级结构

图4 Ct HSFA9的三级结构

1.4 CtHSFA9蛋白的同源性分析

选取莴苣、刺菜蓟、向日葵等11种植物的CtHS-FA9基因序列，通过DNAMAN进行多源序列比对，然后用MEGA5.1构建系统进化树。对试验中克隆的CtHSFA9氨基酸序列进行进化分析。结果显示在氨基酸序列N段具有典型的DBD结构域(图5),其是HSF具有的特征结构域(Scharf et al.,2012)。系统发育树结果表明整个发育树可分为三大支，小果咖啡、普通烟草、林烟草和马铃薯分为一大支，牵牛花单独为一支，刺菜蓟、红花等植物分为一大支，其中红花与刺菜蓟进一步分为一分支，表明红花CtHSFA9基因与刺菜蓟的亲缘关系最近。MEME网站分析结果显示，红花CtHSFA9基因列与其他植物HSF基因序列均含基序1、基序2、基序3基序4，虽然红花中基序3和基序4位置与其他基因序列相反，但其他均一致，相似结构预示CtHSFA9基因也具有HSF基因功能(图6)。

1.5红花热激转录因子CtHSFA9基因表达

利用RT-q PCR检测红花发育不同时期种子(10 DAF,14 DAF,18 DAF及22 DAF)以及红花根、茎、叶、花组织的CtHSFA9基因的表达情况(图7),CtHSFA9基因表达量在18 DAF和22 DAF的种子和根中表达量相对较高，而在茎、叶、花及其他被检测的不同发育时期的种子中表达水平相对较低。课题组前期研究发现，红花种子在18～22 DAF后，处于种子快速脱水时期，推测种子的脱水信号诱导了CtHSFA9基因的大量表达，由此可见该基因可能参与植物的干旱响应。

图5 Ct HSFA9氨基酸序列比对

图6 Ct HSFA9蛋白系统进化树和模体分析

图7 Ct HSFA9基因在不同组织及不同时期种子中相对表达量

2、讨论

随着全球气候变暖，生态环境逐渐恶劣，对主要粮食作物、经济作物以及药用植物等造成严重危害，因此，了解耐旱植物的耐旱机制，以期通过分子手段及转基因技术来改良植物本身，使其具有较强的抵抗非生物胁迫能力显得至关重要。

植物在抵抗非生物胁迫(高温,干旱等)的过程中，形成了一系列分子、生理生化、形态等水平的防御和适应机制(付晨熙等,2016)。目前研究表明，植物响应高温胁迫的调控途径主要有热激转录因子-热激蛋白途径(HSF-HSP)、钙离子-钙调蛋白途径(Ca2+-CaM)、活性氧途径、激素调控及细胞未折叠蛋白相应途径(UPR)(Mittler et al.,2012)。其中以HSF-HSP为主要途径。本试验在红花中克隆热激转录因子基因，通过序列分析及表达分析，初步鉴定红花热激转录因子CtHSFA9基因。CtHSFA9基因序列全长1 326 bp，编码441个氨基酸。CtHSFA9基因在多个植物中存在较高的同源性。多序列同源比对和进化树分析表明该基因具有典型HSF结构域。与刺菜蓟的同源性较近。同时RT-PCR结果表明CtHS-FA9基因在脱水时期的种子发育18～22 DAF和根中相对表达量最高，叶次之，花中最低。分析可能的原因为18～22 DAF的种子处于快速脱水的时期，种子的脱水信号诱导了CtHSFA9基因表达。曾有研究表明干旱等非生物胁迫导致植物脱水可诱导大量热激蛋白的表达(段硕楠等,2018)，而热激蛋白表达需要依靠热激转录因子与启动子区热激元件相结合，故在红花种子发育18～22 d可检测到相关基因表达。CtHSFA9基因在根中高表达，推测因为该基因主要在根中发挥生物学功能，因此该基因在红花根受到胁迫伤害时发挥重要功能。

虽然国内外已有关于HSFA9基因功能的相关研究，然而不同植物中HSFA9基因功能具有较明显差异。近年来国内外分别在棉花(Wang et al.,2014)、水稻(Mittalet al.,2009)等植物中克隆得到了HSFA9基因，经组织表达分析发现其在种子中具有特异表达性。有研究曾在测定车前根组织中热激蛋白有积累，推测热激蛋白的积累除受高温、脱水影响外，也有可能因脱落酸(ABA)等物质刺激而引起热激转录因子发挥功能(Alamillo et al.,1995)。随着研究的深入，将进一步对不同热激转录因子的协同作用进行探索。有研究发现HSFA9基因在植物体内发生作用，可能与一些转录因子或蛋白协同作用，当烟草中缺失HSFA9后，一些HSP基因表达会下调，并且HSFA9同另外的一些HSFs基因一起控制HSP基因的表达，从而影响种子寿命(Tejedorcano et al.,2010)。试验发现HaHSFA9和HaDREB2没有直接的相互作用，因此推测还存在一个或几个种子特异转录因子或其他修饰蛋白可以与HaHSFA9和HaDREB2相互作用，从而调控HSPs等基因的表达(Almoguera et al.,2009)。

关于红花中热激转录因子CtHSFA9在抗逆性过程中所发挥的作用及分子机理还有待于进一步探究。目前本试验正在进一步构建关于CtHSFA9基因的过表达载体，并将重组载体转化拟南芥植株，对转基因植株的抗逆性进行评价。并根据前期转录组数据，初步对CtHSFA9转录因子调控的下游基因进行筛选。为后续开展红花逆境相关转录因子的机理研究做铺垫，同时也为植物抗逆性状的改良提供研究基础。

3、材料与方法

3.1试验材料

供试材料为‘川红1号’红花品种，经四川农业大学吴卫教授鉴定，种植于四川农业大学温江教学试验基地。田间收取成熟红花的10 DAF、14 DAF、18 DAF、22 DAF种子及红花幼嫩根、茎、叶和花植物器官置于液氮冷冻的离心管中，置于-80℃冰箱备用。

3.2总RNA提取及cDNA第一链合成

液氮研磨种子样品，按照Omega总RNA提取试剂盒(R6934-01E.Z.N.A.TMTotal RNA KitⅡ)说明书，对红花材料的总RNA进行提取，具体试验操作方法见试剂盒说明书，利用NanoDrop 2000分光光度计进行浓度测定，提取的总RNA利用琼脂糖凝胶电泳检测其质量和完整性。利用反转录试剂盒(TaKaRa,中国)在PCR仪(Bio-Rad,美国)上将总RNA反转录为第一链(cDNA)，反转录操作步骤详见其说明书。

3.3 HSFA9基因序列的克隆

以红花组织混合cDNA作克隆模板，根据转录组测序的Unigene基因序列进行分析，设计引物(PF1/PR1)并进行PCR扩增。反应程序如下：94℃5 min;94℃40 s;56℃40 s;72℃90 s;72℃10 min;12℃forever;35个循环。经琼脂糖凝胶电泳检测获得预期大小的片段，利用胶回收试剂盒回收目的片段，连接到pClone007-T载体上，涂布于含氨苄青霉素抗性的LB培养基上，37℃培养18 h。挑取单独菌斑送往公司测序(Tsingke,中国)。

3.4序列生物信息分析

使用ORF finder对序列开发阅读框及氨基酸进行预测，利用NCBI中BLAST对测序结果进行分析。使用ProtParam对蛋白质的相对分子质量、平均疏水性、等电点等进行分析。利用SMART软件对红花热激转录因子氨基酸序列功能结构域进行预测。使用Signal P3.0在线分析工具对红花热激转录因子氨基酸序列进行信号肽的可能性分析。使用Prot Scale在线工具对红花CtHSFA9蛋白的疏水性和亲水性进行预测分析。使用DNAMAN软件进行氨基酸多源序列比对的分析。使用MEGA 5.1软件构建关于红花的系统进化树，使用MEME网站分析系统发育树中序列的模体结构。利用IBCP的在线工具SOPMA对CtHSFA9二级蛋白结构进行预测，并利用SWISS-MODLE预测其三级蛋白结构。

3.5荧光定量PCR

实时PCR检测系统对基因进行RT-qPCR表达分析。利用Primer 3.0在线引物设计软件设计荧光定量PCR引物及内参基因CtEF1α引物(内参基因选择根据相关研究选定)(杨晶等,2017)(表1)。荧光定量试验采用Bio-Rad-CFX96实时定量系统，试剂使用SYBR green I master mix(北京天根生化科技有限公司)进行定量PCR反应。反应体系为10μL体系，Real-time PCR反应体系如下：5μL SYBR green I master mix,1μL cDNA,0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，3μL Rnase free ddH2O。首先将相同组分混匀配成混合液，之后分别加入不同体系中，以保证反应条件一致性。再加入差异组分。反应条件是：94℃下90 s，随后进行35个循环的94℃10 s;56℃5 s;72℃10 s。通过熔解曲线分析监测PCR扩增的特异性，反应程序从55℃到94℃0.1℃/s速度，对产物进行测序分析。

在反应过程中，设定以纯水为模板的(其他条件均一致)PCR管作为阴性对照。每个荧光定量PCR反应重复3次。数据通过2-ΔΔCT相对定量法对基因进行表达水平分析。

表1试验中所用Ct HSFA9基因引物序列,名称及用途

参考文献：

[1]段硕楠,李国良,张园园,郭秀林,2018,植物热激转录因子家族的多样性和复杂性研究进展,中国农学通报,34(35):36-43.

[2]付晨熙,肖自华,高飞,周宜君,2016,植物应答非生物胁迫的蛋白质组学研究进展,基因组学与应用生物学,35(12):3569-3582.

[3]黎帮勇,胡尚连,曹颖,徐刚,2015,毛竹NAC转录因子家族生物信息学分析,基因组学与应用生物学,34(8):1769-1777.

[4]王果平,帕丽达,李晓瑾,石明辉,何震,2010,药用植物红花新疆产地适应性数值分析,中国民族民间医药,19(23):49-50.

[5]杨晶,卢玉彬,迟孟涵,王清曼,刘伟灿,强卫东,张晓美,胡会龙,邓思楠,2017,红花种子不同发育时期内参基因表达稳定性分析,中草药,48(9):1845-1850.

于景盛,李丹丹,牟青山,许鑫,吴卫,刘雅洁.红花(Carthamus tinctorius)热激转录因子CtHSFA9的克隆及表达分析[J].分子植物育种,2020,18(12):3886-3892.

基金:国家自然科学基金项目(81274020);四川农业大学创新训练计划项目(201710626079)共同资助.