板蓝根是我国重要的传统中药之一，为十字花科植物，具有清热解毒和凉血利咽的功效，用于治疗流感、流行性肝炎和流行性乙型脑炎已有数百年的历史[1]。研究表明，板蓝根提取物中鉴定出了生物碱类、有机酸类、木脂素类、芥子苷类、核苷类、黄酮类、氨基酸类、甾醇类、含硫类化合物和微量元素等成分[2]，其中板蓝根多糖（isatis root polysaccharide,IRPS）是最重要的活性成分之一，主要由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和半乳糖组成[3]，具有抗菌及抗病毒等功效[4]。

单纯疱疹病毒-2型（herpes simplex virus type-2,HSV-2）主要通过皮肤和黏膜感染，是引起生殖器疱疹（genital herps,GH）主要病因之一。研究表明，超过85%的生殖器疱疹患者由HSV-2引起[5]，接种疫苗是预防其感染的有效途径。DNA疫苗纯度高，特异性强，能诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫，具有重组亚单位疫苗的安全性、减毒活疫苗诱导全面免疫应答的高效性和同种异株的交叉保护作用。但DNA疫苗的免疫原性较弱，导致其保护和治疗作用受限[6]。因此，寻找合适的免疫佐剂以提高HSV-2 DNA疫苗对机体的保护力显得尤为重要。近年研究发现，中药多糖可增强机体的免疫功能，如通过刺激单核-巨噬细胞系统的吞噬功能，促进T、B淋巴细胞增殖和转化、抗体生成及细胞因子的分泌等[7]。本实验使用水煎醇沉法提取IRPS，与HSV-2 DNA疫苗共免疫小鼠，观察IRPS对该疫苗免疫效果的影响，探讨其作为疫苗佐剂的可能性。

1、 材料与方法

1.1原料

板蓝根粉末购自祁新中药颗粒饮片有限公司。

1.2疫苗

HSV-2 DNA疫苗pg D（含HSV-2糖蛋白g D全长序列基因）[8]由浙江省医学科学院生物工程研究所提供。

1.3载体及病毒

真核表达载体pc DNA3kan(p Kan）由浙江省医学科学院生物工程研究所提供；灭活HSV-2(Sav株）由该所培养及保存。

1.4主要试剂

DNA marker DM1000及无内毒素质粒中量抽提试剂盒购自杭州新景生物试剂开发有限公司；快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；Cell Titer 96A誖Queous单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司；刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A）购自美国Sigma公司；葡萄糖标准品由广东省化学试剂工程技术研究开发中心提供；RPMI1640完全培养液购自美国Gibco公司；HRP标记的羊抗鼠Ig G、Ig G1和Ig G2a试剂盒均购自美国Abcam公司；IFNγ和IL-10试剂盒购自美国Thermo Fisher Scientific公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.5实验动物

SPF级雌性BALB/c小鼠，40只，鼠龄6～8周，体重18～22 g，购自浙江省实验动物中心，动物合格证号：SCXK（沪）2018-0006。

1.6 IRPS的提取

采用水煎醇沉法。称取200 g板蓝根粉末，按料液1∶15的比例加入3 L蒸馏水，于55℃水浴，纱布过滤，3 000×g离心10 min，收集上清，经旋转蒸发仪浓缩至400 m L（真空度：8 mbar，旋转速率：1×105r/min，水浴温度：39.5℃），加入4倍体积95%乙醇，静置醇沉72 h;3 000×g离心10 min，收集上清，透析48 h；再次旋转蒸发，冷冻干燥，即获得IRPS。

1.7 IRPS含量的测定

称取10 mg葡萄糖标准品，用蒸馏水溶解，定容至100 m L，取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 m L至试管中，分别补加蒸馏水至2.0 m L，每组设3个平行。加入5%苯酚溶液1.0 m L，摇匀，沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0 m L，室温静置30 min，用酶标仪检测A450值。以葡萄糖标准品质量为横坐标，A450值为纵坐标，绘制标准曲线。精确称量IRPS10 mg，用蒸馏水溶解，定容至50 m L。取1.0 m L至试管中，补加蒸馏水至2.0 m L，后续检测同上。将所得A450值代入标准曲线方程，得出多糖含量，计算产率。

1.8动物分组及给药

将40只BALB/c小鼠随机分为PBS对照组、pg D疫苗组（100μg）、pg D+IRPS组（100μg+150μg）、p Kan+IRPS组（100μg+150μg）、IRPS组（150μg），每组8只，均经小鼠后腿肌肉注射，100μL/只，初次免疫后2周，加强免疫1次，免疫剂量及途径同上。

1.9小鼠血清中HSV-2特异性Ig G水平的检测

末次免疫2周后，经小鼠眼球采血，分离血清。用灭活的HSV-2包板96孔板，100μL/孔，于4℃包被12 h；加入待测血清（1∶20稀释），100μL/孔，37℃静置30 min；加入HRP标记的羊抗鼠Ig G(l∶4 000稀释），100μL/孔，37℃静置30 min；加入TMB,100μL/孔，避光放置10～15 min,2 mol/L H2SO4终止显色反应，酶标仪检测A450值。以PBS组免疫血清为阴性对照，待测血清A450/阴性对照A450≥2.1时判为阳性。

1.1 0小鼠血清中HSV-2特异性Ig G1及Ig G2a亚型抗体滴度的检测

采用1.9项方法检测pg D+IRPS组及pg D组小鼠血清。待测血清按101～104倍稀释，二抗为HRP标记的羊抗鼠Ig G1和Ig G2a，稀释度均为1∶4 000。待测血清A450/阴性对照A450≥2.1时判为阳性，并按下式计算抗体滴度的几何平均值（G）。

公式

式中X为阳性样本的最高稀释倍数，n为样本数。

1.11小鼠脾脏T细胞增殖能力的检测

采用MTS法。各项血清检测后，无菌取各组小鼠脾脏，制备为5×106个/m L的脾细胞悬液，加入至96孔板中，100μL/孔，同时设HSV-2特异性抗原刺激组（加入100μL灭活的HSV-2，终浓度为50μg/m L）、Con A非特异性抗原刺激组（加入100μL Con A，终浓度为10μg/m L）、阴性对照组（加入100μL RPMI1640完全培养液）和空白组（不加脾细胞悬液，仅加入200μL RPMI1640完全培养液），将培养板置37℃，5%CO2细胞培养箱中培养68 h；加入MTS溶液，40μL/孔，继续培养4 h；酶标仪检测A490值，并按下式计算刺激指数（SI）。

1.1 2小鼠脾脏细胞IFNγ和IL-10含量的检测

将各组小鼠脾脏细胞悬液浓度调整为2×107个/m L，加至96孔板，100μL/孔，置37℃，5%CO2细胞培养箱培养48 h,-20℃冻存。采用IFNγ和IL-10试剂盒进行含量检测。

1.1 3统计学分析

应用Origin软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准差表示，两独立样本间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 IRPS含量

葡萄糖标准曲线见图1，获得回归方程为：y=0.006 9 x+0.039 7,R2=0.995 5。IRPS样品的A450为6.074,IRPS含量约8.745 mg，计算IRPS产率为87.45%。

图1葡葡糖标准曲线

2.2小鼠血清中HSV-2特异性Ig G水平

pg D+IRPS组和pg D组的Ig G水平均显著高于PBS组（t分别为14.020和9.047,P<0.001）、p Kan+IRPS组（t分别为13.853和8.988,P<0.001）和IRPS组（t分别为13.381和8.264,P<0.001）；其中pg D+IRPS组HSV-2特异性Ig G的水平最高，显著高于pg D组（t=4.784,P<0.001）。见图2。

图2各组小鼠血清中HSV-2特异性Ig G的抗体水平

注：aaa表示与PBS组比较，P<0.001;bbb表示与pg D组比较，P<0.001。

2.3小鼠血清中HSV-2特异性Ig G1及Ig G2a亚型抗体滴度

pg D+IRPS组小鼠血清中特异性Ig G1和Ig G2a滴度均显著高于pg D组（t分别为3.843和6.831,P<0.01），见图3;Ig G2a/Ig G1比值（1.256±0.116）显著高于pg D组（1.149±0.083），且差异有统计学意义（t=2.122,P=0.038）。

图3小鼠血清中HSV-2特异性Ig G1和Ig G2a抗体滴度

2.4小鼠脾脏T细胞的增殖能力

在HSV-2刺激下，pg D+IRPS组SI值显著高于PBS组、p Kan+IRPS组、IRPS组和pg D组（t分别为5.520、4.151、5.547、1.873,P<0.05);pg D组显著高于PBS组（t=3.144,P=0.004）。见图4。

图4 MTS法检测小鼠脾脏T细胞的增殖能力

2.5小鼠脾脏细胞IFNγ和IL-10的含量

pg D+IRPS组小鼠脾细胞IFNγ含量显著高于PBS组、pg D组、p Kan+IRPS组、IRPS组（t分别为23.726、9.919、10.539、11.235,P<0.001),pg D组显著高于PBS组（t=13.428,P<0.001），见图5;pg D+IRPS组小鼠脾细胞IL-10含量显著高于PBS组、pg D组、p Kan+IRPS组、IRPS组（t分别为23.050、8.049、11.519、10.029,P<0.001),pg D组显著高于PBS组（t=18.688,P<0.001）。见图6。

图5小鼠脾脏细胞IFNγ含量

图6小鼠脾脏细胞IL-10的含量

3、讨论

HSV-2是线性双链DNA病毒，初次感染时通过表面糖蛋白g D与宿主细胞结合，随后潜伏在神经细胞中[9,10]，该特性导致普通疫苗难以发挥作用。DNA疫苗具有工艺简单、分子稳定、毒性低、易多价化等优点，已成为HSV-2疫苗研究的热点。何方等[8]构建了一个含卡那霉素抗性基因的真核表达质粒，以此为基础构建了含HSV-2糖蛋白D全基因序列的HSV-2 DNA疫苗pg D，结果发现，pg D能够诱导小鼠产生较好的体液免疫反应，且在致死性攻毒试验中呈现75%的保护率。由于DNA疫苗的免疫原性较弱，需寻找一种免疫佐剂以提高HSV-2 DNA疫苗对机体的保护力。

IRPS作为中药多糖具有独特的生物活性，已应用于多项免疫方面的研究[11,12]。邱妍等[13]用新城疫传染性支气管炎二联（Newcastle disease-infectious bronchitis）弱毒疫苗通过点眼滴鼻免疫公鸡，再分别通过肌肉注射高、低剂量的IRPS，结果发现，IRPS能显著提高新城疫Ⅲ抗体效价，且CD4+/CD8+比值也明显高于对照组，表明IRPS对新城疫疫苗的免疫效果有明显的增强作用。本研究结果表明，经2次免疫，pg D+IRPS组小鼠的Ig G值最高，且也显著高于pg D组（P<0.01），表明IRPS能显著增强小鼠的特异性免疫。

有研究表明，Ig G1和Ig G2a抗体在小鼠体内分别由Th2和Th1型细胞因子诱导产生[14],Th1型细胞因子主要参与细胞免疫，Th2型细胞因子主要参与体液免疫，因此Ig G1和Ig G2a的抗体滴度在一定程度上可反映体液免疫和细胞免疫的水平，而Ig G2a/Ig G1可反映Th1/Th2的诱导免疫方向。本实验结果显示，pg D+IRPS组小鼠血清中Ig G2a和Ig G1的抗体滴度显著高于pg D组（P<0.01），表明其诱导的是Th1和Th2的混合型免疫，Ig G2a/Ig G1值也显著高于pg D组（P<0.05），表明IRPS作为佐剂能调节免疫方向往Th1转换，以细胞免疫为主导来参与Th1和Th2的混合免疫反应。

本研究结果还表明，在HSV-2的刺激下，pg D+IRPS组小鼠脾脏T细胞增殖能力显著高于其他组（P<0.05），表明IRPS作为疫苗佐剂能显著提高pg D引起的细胞免疫，但效果弱于Con A。ELISA检测结果显示，pg D+IRPS组小鼠脾细胞的IFNγ和IL-10含量显著高于其他组（P<0.01）。活化的Th1细胞在免疫过程中分泌IFNγ，而IL-10由活化的Th2细胞分泌，因此，表明IRPS能显著增强Th1与Th2细胞分泌细胞因子的功能。

综上所述，IRPS作为疫苗佐剂能显著增强HSV-2 DNA疫苗pg D的免疫水平，具有良好的应用前景。

参考文献：

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周寒鹏,陶薇,傅婷,何卓晶,洪艳.板蓝根多糖对单纯疱疹病毒-2型DNA疫苗免疫效果的影响[J].中国生物制品学杂志,2020,33(06):609-613.

基金:浙江省中医药科技计划(2017ZB023).