口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus,FMDV）引起的一种常发生于偶蹄动物（牛、猪、羊等）的热性、急性、高度接触性传染病。国际动物卫生组织（Office International Des Epizooties,OIE）将FMD列为法定上报传染病，中国农业部将其列为一类传染病之首[1,2]。FMDV有7个血清型，不同血清型间几乎不存在交叉保护，这给FMD的诊断和预防造成了极大困难。7个血清型中除C型FMDV未见流行外，其他6个血清型在全球范围内均有流行，其中O型FMDV是引起FMD暴发的主要病原菌。据统计，2010～2014年中国向OIE上报O型FMDV暴发次数累计38次，涉及13个省、直辖市及自治区，造成了巨大的经济损失[3]。

FMDV是口蹄疫病毒属成员，为单股正链RNA病毒，其编码4种结构蛋白（VP1、VP2、VP3、VP4）和10种非结构的蛋白（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D及3AB、3ABC复合体）[4,5]。4种结构蛋白中，VP1基因最易发生变异，不同血清型之间的变异率为30%～50%[6]。

FMD诊断技术中血清学检测技术应用最广泛，主要有免疫扩散试验（agar gel immunodiffusion,AGID）、补体结合试验（complement fixation test,CFT）、病毒中和试验（virus neutralization test,VNT）、凝集试验、酶联免疫吸附试验（enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA）等。普遍认为VNT是实验室诊断FMD的经典方法，其检测结果准确可靠，但存在实验条件要求高、安全性低、操作繁琐、费时等缺点[7,8]。1979年，ELISA检测技术首次报道用于FMDV检测[9]，随后经CROWTHER等[9]、VAN MAANEN等[10]、YANG等[11]、厍大亮等[12]证实，该方法具有敏感、特异、快速、简单、低成本等优点。目前ELISA法主要包括液相阻断ELISA、竞争ELISA、间接ELISA、夹心ELISA等，每种方法均存在优缺点[13,14]。市场对未来检测技术的发展要求为精准、高效、简单、安全及低成本等[13]，新方法的建立对FMD的控制至关重要[15]。本研究采用O型FMDV病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）作为包被抗原，建立竞争ELISA检测法，并进行验证，以期用于O型FMDV血清抗体的检测。

1、 材料与方法

1.1血清样品

所有血清样品均由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。

1.2 O型FMDV VLP

由兰州兽医研究所家畜疾病病原生物学实验室制备，经原核表达纯化、酶切并体外自组装后获得，该VLP是O型FMDV的完整衣壳蛋白，含本研究所需抗原位点[16]。

1.3主要试剂及仪器

酶标抗体（HRP-IgG，由O型FMDV疫苗免疫家兔获得）由兰州兽医研究所兽用纳米材料与应用实验室制备及保存；HRP标记的兔抗猪IgG购自美国Thermo公司；碳酸盐粉剂购自美国Sigma公司；BSA购自美国VWR公司；底物TMB购自美国SURMODICS公司；O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所；其他试剂均为分析纯；96孔板购自美国Corning公司。

1.4 O型FMDV VLP的鉴定

将FMDV VLP经SUMO-蛋白酶酶切后进行12%SDS-PAGE及Western blot鉴定。Western blot鉴定时一抗为O型FMDV阳性猪血清（1∶1 000稀释），二抗为HRP标记的兔抗猪IgG(1∶2 000稀释）。

1.5方法的建立

将O型FMDV VLP按0.5μL/mL包被96孔板，100μL/孔；PBST洗涤3～4次，加入封闭液，120μL/孔，于37℃封闭；PBST洗涤3～4次，同时加入标准阳性血清、标准阴性血清、待检血清（用PBST稀释）及HRP-IgG（用PBST稀释），均50μL/孔，振荡混匀，37℃孵育；PBST洗涤3～4次，加入TMB,50μL/孔，37℃显色；加入终止液，50μL/孔，用酶标仪测定A450值。

1.6方法的优化

1.6.1抗原包被浓度及血清稀释度的确定

采用棋盘交叉滴定法。将抗原O型FMDV VLP用碳酸盐缓冲溶液稀释为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0μg/m L，每个浓度设2个复孔，100μL/孔，4℃包被过夜；PBST洗涤3～4次，用1%BSA溶液于37℃封闭30 min;PBST洗涤3～4次，加入用PBST按1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例稀释的标准阴性血清及标准阳性血清，每个稀释度设2个复孔，同时加入等体积的HRP-IgG(1∶20 000稀释），振荡混匀30～60 s,37℃孵育30 min;PBST洗涤3～4次，加入底物TMB,37℃避光显色15 min；加入终止液，用酶标仪检测A450值，计算N/P值（N为阴性血清的A450值，P为阳性血清A450值），以该值最大时作为最适抗原包被浓度和血清稀释度。

1.6.2 HRP-IgG稀释度的确定

采用方阵滴定法。用最适抗原包被浓度和血清稀释度进行检测，将HRP-IgG用PBST按1∶10 000～1∶20 000稀释，共11个浓度，其他步骤同1.6.1项，计算N/P值，以N/P值最大时作为最适HRP-IgG稀释度。

1.6.3抗原包被温度及时间的确定

采用最适抗原包被浓度、血清及HRP-IgG稀释度进行检测，抗原分别于4℃过夜、37℃1 h、37℃1.5 h、37℃2 h、37℃2.5 h、37℃3 h不同条件下包被96孔板，每种条件下分别检测已知背景的6份猪血清（阳性或阴性），同时检测标准阳性血清及标准阴性血清，其他步骤用1.6.1项，并按下式计算6份猪血清样品的抑制率，根据抑制率统计分析结果确定抗原最适包被温度及时间。

抑制率（%）=（标准阴性血清A450值-猪血清样品A450值）/（标准阴性血清A450值-标准阳性血清A450值）×100%

1.6.4封闭液的确定

采用最适抗原包被浓度、抗原作用温度及时间、血清及HRP-IgG稀释度进行检测，将包被好的96孔板分别于4种不同的条件下处理，即不封闭、1%BSA封闭、2%BSA封闭、5%脱脂乳封闭。每种条件分别检测已知背景的6份猪血清（阳性或阴性），同时检测标准阳性血清及标准阴性血清，其他步骤同1.6.1项，计算6份待检猪血清样品的抑制率（公式同1.6.3项），根据抑制率分析统计结果确定最适封闭液。

1.6.5封闭液作用时间的确定

采用最适抗原包被浓度、抗原作用温度及时间、血清及HRP-IgG稀释度进行检测，加入最适封闭液后，于37℃分别封闭30、60、90、120 min。每种条件下分别检测已知背景的6份猪血清（阳性或阴性），同时检测标准阳性血清及标准阴性血清，其他步骤同1.6.1项，计算6份待检血清样品的抑制率（公式同1.6.3项），根据抑制率分析统计结果确定封闭液的最适作用时间。

1.6.6血清与HRP-IgG作用时间的确定

采用最适抗原包被浓度、抗原作用温度及时间、封闭液、封闭液作用温度及时间、血清及HRP-IgG稀释度进行检测，加入血清和HRP-IgG后，于37℃分别作用30、60、90、120、150 min。每种条件下分别检测已知背景的6份猪血清（阳性或阴性），同时检测标准阳性血清及标准阴性血清，其他步骤同1.6.1项，计算6份待检血清样品的抑制率（公式同1.6.3项），根据抑制率分析统计结果确定血清和HRP-IgG的最适作用时间。

1.6.7底物TMB作用时间的确定

采用最适抗原包被浓度、抗原作用温度及时间、封闭液、封闭液作用温度及时间、血清及HRP-IgG稀释度、血清和HRP-IgG作用时间进行检测，加入底物TMB后，于37℃分别作用10、15、20、25、30 min。每种条件下分别检测已知背景的6份猪血清（阳性或阴性），同时检测标准阳性血清及标准阴性血清，其他步骤同1.6.1项，计算6份待检血清样品的抑制率（公式同1.6.3项），根据抑制率分析统计结果确定底物TMB的最适作用时间。

1.7判断标准的确定

采用优化方法检测已知背景的102份猪血清，包括52份O型FMDV阴性猪血清和50份O型FMDV阳性猪血清。计算各血清的抑制率（公式同1.6.3项），根据检测已知背景的血清计算出的抑制率，应用SPSS 17.0软件绘制ROC曲线，选择敏感性和特异性均较高的作为阴阳性血清的判断标准（cut-off值）。

1.8方法的验证

1.8.1交叉反应试验

用建立的方法分别检测3份O型FMDV阳性猪血清、1份A型FMDV阳性猪血清及17份常见猪病阳性血清（猪圆环病毒2型、猪细小病毒病、猪流行性腹泻病、猪蓝耳病、猪传染性胃肠炎病、猪瘟、猪传染性胸膜肺炎、猪乙型脑炎、猪大肠埃希菌病、副猪嗜血杆菌病），计算各样品的抑制率（公式同1.6.3项），根据结果判断该方法是否存在交叉反应。

1.8.2特异性及敏感性

用建立的方法分别检测猪、牛的O型FMDV血清，其中O型FMDV阳性血清114份，O型FMDV阴性血清213份。计算各样品的抑制率（公式同1.6.3项），并按下式计算该方法的特异性和敏感性。

1.8.3精密性

选择同一批次包被的3块酶标板，用优化的方法分别检测已知背景的6份猪血清（3份阳性血清和3份阴性血清），每份血清设3个重复，计算各样品的平均抑制率、标准差（SD）及批内变异系数（CV）。选择不同批次包被的3块酶标板，用优化方法分别检测6份猪血清（3份阳性血清和3份阴性血清），每份血清设3个重复，计算各样品的平均抑制率、SD及批间CV。

1.9符合率试验

采用建立的方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒分别检测未知血清背景的138份猪和牛血清，统计分析结果，计算两者的符合率。

2、结果

2.1 O型FMDV VLP蛋白的鉴定结果

FMDV VLP的SUMO-蛋白酶酶切产物经12%SDD-PAGE分析，可见相对分子质量约50 000、45 000和43 000的目的蛋白条带，大小与预期相符，见图1;FMDV VLP的SUMO-蛋白酶酶切产物可与O型FMDV阳性猪血清发生特异性反应，于相对分子质量约35 000、27 000和25 000处可见特异性结合条带，见图2。表明FMDV VLP蛋白可作为O型FMDV VLP竞争ELISA抗体检测方法的包被抗原。

图1 O型FMDV VLP的SDS-PAGE分析

图2 O型FMDV VLP蛋白的Western blot鉴定

2.2方法的优化结果

2.2.1最适抗原包被浓度及血清稀释度

当抗原包被浓度为0.5μg/mL，标准阴、阳性血清稀释度为1∶4时，N/P值达最大，见表1。因此确定最适抗原包被浓度及血清稀释度分别为0.5μg/mL和1∶4。

表1抗原包被浓度和血清稀释度的优化结果

Tab 1.Optimization of antigen concentration for coating and serum dilution    下载原表

表1抗原包被浓度和血清稀释度的优化结果

2.2.2最适HRP-IgG稀释度

当HRP-IgG稀释度为1∶18 000时，N/P值达最大，见表2。因此确定最适HRP-IgG稀释度为1∶18 000。

表2 HRP-IgG稀释度的优化结果

2.2.3最适抗原最佳包被温度及时间

当选用4℃过夜或37℃2.5 h两种条件进行抗原包被，所检测出的试验结果与血清已知背景相符，其他条件下检测结果均与血清实际背景不符，见表3。由于蛋白于4℃条件下稳定性更好，因此确定最适抗原最佳包被温度及时间为4℃过夜。

表3抗原包被温度和时间的优化结果[抑制率（%）]

2.2.4最适封闭液

封闭液为1%BSA或2%BSA的检测结果与血清已知背景相符，其他条件均不符，见表4。为降低成本，确定封闭液为1%BSA。

表4封闭液的优化结果[抑制率（%）]

2.2.5最适封闭液作用时间

4种条件的检测结果均与血清已知背景相符合，见表5。为提高试剂盒的检测效率，确定封闭液的最适作用时间为30 min。

表5封闭液作用条件的优化结果[抑制率（%）]

2.2.6最适血清及HRP-IgG作用时间

作用30及60 min的结果与血清已知背景相符，其他条件的检测结果均与血清已知背景不符，见表6。为提高试剂盒的检测效率，确定血清与酶标抗体最适作用时间为30 min。

表6血清与HRP-IgG作用时间的优化结果[抑制率（%）]

2.2.7最适底物TMB作用时间

底物TMB在4种不同作用时间下检测的结果均与血清已知背景相符，见表7。为提高试剂盒的检测效率，确定底物的最适作用时间为10 min。

2.3判断标准的确定

ROC曲线见图3,ROC曲线下面积（AUC）为0.999，表明该方法具有高的准确性。ROC曲线选择特异性和敏感性均高者，即当待检血清样品PI≥50%时，判为阳性；PI<50%时，判为阴性。

2.4方法的验证结果

2.4.1交叉反应

21份不同猪病的阳性血清中，除3份O型FMD阳性血清的抑制率>50%，为阳性外，其他血清样品抑制率均<50%，为阴性，该方法无交叉反应。

表7底物作用时间的优化结果[抑制率（%）]

图3 ROC曲线

2.4.2特异性和敏感性

竞争ELISA法分别检测出阳性血清103份，阴性血清204份，特异性为95.7%，敏感性为90.4%，表明该检测方法具有较高的特异性和敏感性。

2.4.3精密性

批内及批间CV均<10%，见表8和表9。表明该方法具有良好的精密性。

表8批内精密性验证结果（%）

表9批间精密性验证结果（%）

2.5符合率试验结果

采用本实验建立方法及O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测138份血清，分别检出阳性血清79和75份，阴性血清63和59份，两者符合率为97%。

3、讨论

研究表明，VP1是FMDV最重要的抗原位点，也是FMDV抗原位点变异的关键所在，但FMDV编码结构蛋白VP3和VP2上同样存在抗原位点，O型FMDV结构蛋白上至少含有5个中和性抗原位点，分别位于VP1（含有位点1、3、5）、VP2（含有位点2）及VP3（含有位点3）上，且其功能均非常独立[17]。本研究为使抗原位点更全面，提高检测方法特异性和敏感性，选用O型FMDV VLP作为竞争ELISA方法的包被抗原。VLP是由FMDV编码的4种结构蛋白，即VP1、VP2、VP3、VP4构成而不含RNA遗传物质的空心颗粒[16]。选用VLP作为包被抗原，相对于选用单个蛋白或多肽的抗原位点更全面，有利于提高诊断方法的敏感性和特异性等。且与灭活全病毒比较，其可降低假阳性率，提高安全性，不存在散毒的风险。该方法与市售O型FMDV抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测结果的符合率较高，为97%。

竞争ELISA检测方法不仅继承了液相阻断ELISA检测方法的优点，且具有更好的特异性、敏感性、精密性等，但洗涤次数过多，影响样品的检出速率[7]。本研究对其进行了改进，以HRP标记的纯化高免血清制备特异性酶标抗体，作为竞争ELISA方法的竞争抗体，从而减少了检测步骤及洗涤次数，可实现大批量样品的快速检测，同时建立的方法以O型FMD VLPs作为包被抗原，安全性好，不存在散毒风险。且具通过对O型FMDV临床血清样品的初步检测和分析，再次证明本实验建立的方法有良好的特异性、敏感性和精密性，有望应用于FMD防控中FMDV的快速检测。

参考文献:

[1]孙芳芳,董英,薛强,等.口蹄疫病毒分子生物学检测方法研究进展[J].中国畜牧兽医,2013,40(6):190-194.

[7]刘明,徐娜,李志勇,等.口蹄疫诊断技术的研究进展[J].生物技术通报,2010,2010(5):70-73.

[11]厍大亮,陈前锋,武革利,等. ELISA在口蹄疫检测中的应用进展[J].中国兽药杂志,2014,48(1):66-69.

杨志元,白满元,张韵,闻晓波,孙世琪,郭慧琛,冉旭华.O型口蹄疫病毒血清抗体竞争ELISA检测方法的建立及验证[J].中国生物制品学杂志,2020,33(04):438-444.

基金:国家重点研发计划(2016YFD0500700､2016YFE0204100､2017YFD0500900､2017YFD0501100);黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2017-Y43).