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芍药苷调控自噬途径改善眼小梁网细胞功能障碍的作用

2025-01-02 75 上传者：管理员

摘要：目的探讨芍药苷改善小梁网细胞功能障碍的作用机制。方法动物实验：将C57BL/6J小鼠随机分为对照组（不做处理）、模型组（压灌注构建青光眼模型）、芍药苷组(构建青光眼模型后给予50 mg·kg-1的芍药苷处理),每组12只小鼠，治疗14 d后测量眼压后取小梁网组织，用原位末端转移酶标记法（Tunel）法检测细胞凋亡情况，用蛋白质印迹法检测蛋白相对表达水平。细胞实验：将HTMC细胞随机分为正常组（常规培养）、西罗莫司组(50μmol·L-1的自噬诱导剂西罗莫司)、低剂量实验组(50μmol·L-1的西罗莫司+10μmol·L-1的芍药苷)、高剂量实验组(50μmol·L-1的西罗莫司+30μmol·L-1的芍药苷),用蛋白质印迹法检测蛋白相对表达水平，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况。结果治疗14 d后，对照组、模型组、芍药苷组小鼠眼压分别为（12.81±0.83）、（26.31±1.85）和（20.64±1.77）mmHg,原位末端转移酶标记法（Tunel）阳性细胞率分别为（4.86±0.44）%、（30.32±5.15）%和（15.08±1.92）%,自噬相关的微管相关蛋白1轻链3（LC3）Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白相对表达水平分别为0.51±0.06、1.33±0.13和0.72±0.08,CollagenⅠ蛋白相对表达水平分别为0.45±0.07、1.11±0.12和0.72±0.05。模型组的上述指标与对照组比较，芍药苷组的上述指标与模型组比较，在统计学上均有统计学意义（P<0.001,P<0.01）。正常组、西罗莫司组、低剂量实验组、高剂量实验组细胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ分别为0.40±0.03、1.54±0.10、0.98±0.10和0.64±0.06,细胞存活率分别为（100.00±6.25）%、（65.96±6.16）%、（75.22±5.54）%和（82.15±5.14）%,细胞凋亡率分别为（4.80±0.37）%、（19.64±0.97）%、（16.10±0.93）%和（13.16±0.94）%。西罗莫司组的上述指标与正常组比较，低、高剂量实验组的上述指标与西罗莫司组比较，在统计学上差异均有统计学意义（P<0.001,P<0.05）。结论芍药苷可通过抑制自噬途径调节小梁网细胞功能障碍。

关键词：
小梁网细胞
细胞功能障碍
自噬
芍药苷
青光眼
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青光眼是导致不可逆失明的主要原因，其中原发性开角型青光眼是最常见的青光眼类型，其主要危险因素是眼压升高，小梁网功能发生障碍阻碍房水流出，从而导致眼压升高[1]。已有研究指出，在原发性开角型青光眼中，观察到小梁网细胞的减少和结构改变，与房水流出减少有关[2]。芍药苷是从植物牡丹、芍药的根皮中提取而来，是一种水溶性单萜苷，具有神经保护、抗炎等功效，研究发现芍药苷在高眼压动物模型中具有显著的保护作用[3]。本研究旨在通过体内外实验探究芍药苷对小梁网细胞功能障碍的调节及其可能的作用机制。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄8周，体质量20～22 g, 广东导科医药技术有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(粤)2022-0060。本研究经赣州市妇幼保健院伦理委员会批准[伦理批号：伦审科2024第(9)号]。

细胞人小梁网细胞HTMC,购自美国ATCC公司。

药品与试剂芍药苷，规格：每瓶20 mg, 纯度：98.0%,批号：240302,西罗莫司，规格：每瓶10 mg, 纯度：95.0%,批号：240205,均购自成都普思生物科技股份有限公司；托吡卡胺滴眼液，规格：6 mL∶30 mg, 批号：20240120,批准文号：国药准字H22020410,长春长庆药业集团有限公司生产。原位末端转移酶标记法(TdT mediated dUDP nick end labeling, Tunel)试剂盒，购自上海晅科生物科技有限公司；兔抗自噬相关的微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3) Ⅱ/LC3 Ⅰ、苄氯素1(Beclin 1)、纤维连接蛋白(fibronectin, FN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen Ⅰ)、SQSTM1蛋白(sequestosome 1, p62)及二抗、荧光二抗，均购自美国Abcam公司；杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle media, DMEM)培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)细胞增殖试剂盒、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，均购自北京百奥莱博科技有限公司。

仪器TonoLab动物专用眼压计，芬兰Icare公司产品；Biotek Cytation5酶标仪，美国宝特伯腾公司产品；LSM 980 with Airyscan激光共聚焦显微镜，德国蔡司公司产品；CytoFLEX流式细胞仪，美国贝克曼库尔特公司产品。

2 实验方法

2.1 动物实验

2.1.1 模型构建[4]

用托吡卡胺滴眼液对小鼠眼睛散瞳后进行眼睛局部麻醉，然后腹腔注射10 mL·kg-1戊巴比妥钠，麻醉后将小鼠俯卧位固定在操作台，并固定其头部，将30 G针刺入右眼前房，用胶带将针头固定并连接0.9%NaCl瓶，以120 mmHg压力差灌注0.9%NaCl, 40 min后拔除针头，并涂抹红霉素眼膏预防炎症。在建模前和建模后24 h检测大鼠眼压，造模后右眼眼压高于左眼眼压1.5倍以上即为建模成功。

2.1.2 动物分组与处置方法

将小鼠随机分为对照组、模型组、芍药苷组。对照组不做处理，模型组和芍药苷组小鼠根据“2.1.1”方法进行建模，其中芍药苷组在建模后腹腔注射50 mg·kg-1芍药苷，qd,连续给药14 d, 其余组小鼠给予等量的0.9%NaCl。末次给药检测完眼压后处死小鼠，收集小梁网组织进行后续实验。

2.1.3 眼压计测量眼压[5]

在小鼠开始给药时记为第0天，之后在第7天和第14天(末次给药后)测量小鼠眼压：将小鼠麻醉后，用眼压计测量小鼠眼压，每只眼睛连续测量3次取平均值。

2.1.4 Tunel实验检测小梁网组织细胞凋亡情况[6]

取各组小鼠小梁网组织，经包埋后制片(5 μm),经蛋白酶K浸泡后磷酸盐缓冲液清洗，过氧化氢处理5 min, 滴加DNase I溶液孵育5 min, 然后加入TdTase反应液50 μL,孵育60 min, 之后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)试剂进行核染，最后用荧光显微镜观察。

2.1.5 蛋白质印迹实验检测小梁网组织中相关蛋白相对表达水平[6]

各组小鼠小梁网组织用裂解液处理后离心收集上清液，定量后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAFE)电泳并转膜，用封闭液室温封闭2 h后滴加一抗稀释液孵育过夜，滴加二抗稀释液(1∶2 000比例稀释)孵育2 h, 显影后扫描并分析灰度值。

2.2 细胞实验

2.2.1 细胞培养[7]

将HTMC细胞培养在含有50 mg·L-1胎牛血清DMEM培养基中，置于恒温培养箱中培养，细胞融合至85%以上时消化传代，取第3代细胞进行后续实验。

2.2.2 细胞分组与处置方法

将HTMC细胞随机分为正常组、西罗莫司组、低剂量实验组、高剂量实验组。正常组细胞常规培养，西罗莫司组细胞用50 μmol·L-1的自噬诱导药西罗莫司处理细胞24 h, 低、高剂量实验组细胞分别用10、30 μmol·L-1芍药苷和50 μmol·L-1西罗莫司共同处理细胞24 h。

2.2.3 蛋白质印迹实验检测相关蛋白相对表达水平[6]

收集各组细胞，细胞裂解液充分裂解后根据“2.1.5”中描述的步骤检测HTMC细胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1、p62蛋白相对表达水平。

2.2.4 MTT实验检测细胞存活率[7]

将HTMC细胞接种在96孔板中，根据“2.2.2”中方法进行分组处理，并设置空白组，药物处理24 h后每组加入5 mg·mL-1MTT试剂20 μL,培养箱孵育4 h后酶标仪检测570 nm处光密度值，并计算细胞存活率。

2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况[4]

将细胞接种在6孔板中，分组处理后用1×Bingding Buffer 100 μL重悬细胞，加入Annexin V-FITC 5 μL和PI试剂5 μL,混匀后在暗处结合15 min, 然后加入1×Bingding Buffer 400 μL后立即用流式细胞仪检测。

3 统计学处理

用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料用

表示，组间比较用独立样本t检验，多组间比较用单因素方差分析。

二、结果

1 芍药苷对各组小鼠眼压的影响

对照组小鼠不做处理，模型组小鼠构建青光眼模型，芍药苷组小鼠构建青光眼模型后给予50 mg·kg-1的芍药苷处理。

模型组和芍药苷组小鼠0、7、14 d眼压与对照组比较，均显著升高(均P<0.001);芍药苷组小鼠14 d眼压与模型组比较，显著降低(P<0.01),见表1。

2 芍药苷对青光眼小鼠小梁网细胞凋亡的影响

对照组、模型组和芍药苷组小鼠的小梁网组织细胞Tunel阳性细胞率分别为(4.86±0.44)%、(30.32±5.15)%和(15.08±1.92)%,模型组细胞Tunel阳性率较对照组显著升高(P<0.05),芍药苷组Tunel阳性率较模型组显著降低(P<0.05),见图1。

表1 各组小鼠不同时间点眼压的比较（,n=12)

图1用Tunel实验检测细胞凋亡率(×200)

3 芍药苷对青光眼小鼠小梁网组织自噬及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)病理性重塑的影响

模型组小鼠LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1及FN、Collagen Ⅰ蛋白相对表达水平较对照组均显著升高，p62蛋白相对表达水平显著降低(均P<0.001);芍药苷组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1及FN、Collagen I蛋白相对表达水平与模型组相比均显著降低，p62蛋白相对表达水平显著升高(P<0.01,P<0.001),见表2。

表2各组小鼠小梁网组织自噬和细胞外基质(ECM)蛋白相对表达水平的比较

4 芍药苷对HTMC细胞自噬相关蛋白相对表达水平的影响

西罗莫司组细胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1蛋白相对表达水平较正常组均显著升高，p62蛋白相对表达水平显著降低(均P<0.001);低、高剂量实验组LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1蛋白相对表达水平较西罗莫司组均显著降低，p62蛋白相对表达水平显著升高(P<0.05,P<0.01);且高、低剂量实验上述指标组间比较，在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),见表3。

表3各组细胞自噬蛋白相对表达水平的比较

5 芍药苷对HTMC细胞增殖和凋亡的影响

正常组、西罗莫司组、低剂量实验组、高剂量实验组细胞存活率分别为(100.00±6.25)%、(65.96±6.16)%、(75.22±5.54)%和(82.15±5.14)%;细胞凋亡率分别为(4.80±0.37)%、(19.64±0.97)%、(16.10±0.93)%和(13.16±0.94)%。西罗莫司组与正常组比较，细胞存活率显著降低，凋亡率显著升高(均P<0.001);低、高剂量实验组与西罗莫司组比较，细胞存活率均显著升高，凋亡率均显著下降(均P<0.01);高剂量实验组与低剂量实验组比较，细胞存活率和凋亡率在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。

三、讨论

眼睛局部在正常生理过程中处于一种相对稳定的状态，其眼压也在正常范围内波动，而在青光眼患者中房水流出阻力增加，导致眼压升高，小梁网细胞功能障碍及细胞外基质重塑是增加房水流出阻力的重要危险因素[8],因此恢复小梁网组织细胞外基质稳态及减少小梁网细胞凋亡是阻止青光眼进展的重要策略。芍药苷已被证实在高眼压动物模型中具有保护作用[3,9]。FN和Collagen Ⅰ是细胞外基质成分，其高表达表明细胞外基质过度沉积和重塑[10]。本研究中通过高压灌注构建青光眼小鼠模型，小鼠眼压显著升高，提示模型构建成功；本研究观察到芍药苷治疗14 d后小鼠眼压显著降低，同时还观察到，模型组小鼠小梁网组织中小梁网细胞凋亡率显著提高，而芍药苷治疗可明显抑制小梁网细胞凋亡；此外芍药苷治疗后还可降低小梁网组织中FN和Collagen Ⅰ表达水平。本实验结果提示：芍药苷可能通过改善小梁网细胞功能障碍和细胞外基质重塑，降低房水流出阻力，进而改善眼压在青光眼中发挥作用。

在本研究动物实验中观察到，青光眼小鼠小梁网组织中自噬调节蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1表达增强，p62蛋白相对表达水平受到抑制。研究已证实，LC3在自噬体的形成中起着关键作用，LC3 Ⅰ转化为LC3 Ⅱ是自噬体形成的标志，LC3 Ⅱ与自噬受体p62结合并降解，自噬参与清除累积的突变蛋白和错误折叠蛋白，防止毒性聚集，但过度活化的自噬可导致代谢和包括青光眼性视神经病变在内的多种疾病的细胞功能障碍[11-12]。如YAN等[13]在研究中证实，刺激自噬在小梁网细胞中起着有害作用，其表现为抑制自噬挽救了Myocilin基因突变导致的小梁网细胞活力的下降和凋亡增加；黄歆婷[14]研究表明，激活自噬可导致小梁网细胞功能障碍，进而引起眼压升高。本实验结果提示，芍药苷可能通过抑制自噬改善小梁网细胞功能障碍在缓解青光眼中发挥作用，这与YAN等[13]和黄歆婷[14]研究结果相似。

本研究进一步通过体外细胞实验，观察芍药苷对自噬诱导药诱导的小梁网细胞功能障碍的影响，发现经自噬诱导剂诱导后，细胞自噬蛋白LC Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1蛋白相对表达水平提升，p62蛋白相对表达水平受到抑制，且细胞存活率显著降低，凋亡率升高，而芍药苷处理后，可显著降低LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin 1蛋白相对表达水平，提升p62蛋白相对表达水平，并提高细胞存活率、抑制凋亡，且高剂量的芍药苷对上述指标的改善作用显著强于低剂量组，本研究的细胞实验结果与体内实验结果一致，提示芍药苷可通过抑制自噬改善小梁网细胞功能障碍。

本研究提示：芍药苷可能通过抑制自噬，提高小梁网细胞存活率并抑制其凋亡，改善细胞外基质过度沉积，进而改善小梁网细胞功能障碍，阻止青光眼进展。

参考文献:

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