胡杨（Populus eupharatica）是典型的耐旱耐盐碱多年生木本植物，主要分布在中亚干旱荒漠地区内陆河流域两岸，它作为我国西北部干旱盐碱荒漠地带能够成林的唯一高大乔木，具有耐旱、耐盐碱、抗热等特点，在保护盆地生态系统，防止荒漠化和保护生物多样性方面发挥着重要作用[1,2,3,4]。然而胡杨的繁殖问题制约了该树种的发展。使用种子实生繁殖，其后代分化严重，生长参差不齐，且难以生根，使用无性繁殖又很困难。胡杨自然条件下根蘖能力强，可见独树形成小片纯林，但根蘖苗造林成活率低，人工扦插生根困难，嫁接繁殖数量极为有限，质量不稳定，这成为制约胡杨开发利用及研究的重要问题[5]。在胡杨良种选育的过程中，选取胡杨优株之后，为进一步获得生长一致且能保持母株优良性状的群体，组织培养是一种可行的方法。有关胡杨组织培养繁殖的研究较多，主要在胡杨的叶、茎尖、腋芽等部位进行组培研究[6,7,8,9]，有研究者对胡杨雌雄花及花序轴进行离体培养，建立了雌花离体培养的再生体系，但并未使用花药进行单独培养[10,11]。

据报道，已有数个杨树品种通过花药培养获得单倍体植株[12,13,14,15]，实现从杂合体一步到纯合体的转变，在很大程度上减少了育种的成本和育种周期。纯合基因型的杨树，是育种和遗传研究的理想材料，而胡杨尚未获得单倍体植株，所以选择胡杨花药作为外植体，进行单倍体培养的探究。本研究以胡杨的花药作为外植体进行愈伤诱导，愈伤组织分化生成胡杨苗，建立起高效地再生体系。避免了胡杨优树的老化问题，可以使优良株系进行快速扩繁，进而通过建立遗传转化体系，可为胡杨的生理生化、基因鉴定建立技术平台，对于胡杨种质资源的保护、开发和利用提供参考。

1、材料与方法

1.1材料来源

本试验采用胡杨作为植物材料，树龄15～20 a，生长于新疆农业大学校园。1—2月份采取胡杨花枝，剪取带有饱满花芽的胡杨雄株的花枝，置于室温（24±1）℃，光照条件为光照16 h/d的环境下水培。

1.2试验方法

1.2.1外植体消毒

胡杨花芽鳞片层数多，灭菌消毒困难。选择乙醇和次氯酸钠配合使用进行灭菌处理。将胡杨花芽取下，用毛笔轻轻将花芽外部的尘土等杂物去掉，之后在自来水下冲洗10 min。置于超净台里，接着用70%的乙醇浸洗花芽，时间分别设置30 s和1 min；再将其浸入浓度为8%的次氯酸钠溶液中进行表面消毒，处理时间设置为1、2、3 min和4 min；最后用无菌水冲洗3～5次。以上操作在无菌环境中进行。灭菌处理后，接种花药，5 d后开始观察外植体生长情况并记录。

1.2.2愈伤组织诱导

在H基本培养基[16]中添加不同浓度的NAA(0,0.5,1.0,1.5 mg/L）和BA(0,0.5,1.0,1.5 mg/L）。所有的培养基中均添加质量体积分数0.55%的琼脂和质量体积分数3%的蔗糖，并调节pH值为5.5。灭菌后剥去花芽的鳞片，选取花序中部的花药，均匀地接种到培养基上，接种密度为每个培养皿30枚花药，每处理重复3次，在无菌环境中完成。接种后的培养皿密封好，放置于组培室进行暗培养，培养时间为6个月，期间每月将花药转移到新培养基，培养条件不变。

1.2.3不定芽的分化

以MS培养基[17]作为不定芽分化诱导的基本培养基，分别添加浓度为0、0.3、0.6、1.0 mg/L的NAA和浓度为0、0.2、0.4、0.6 mg/L的BA以及浓度为0、0.02、0.1的GA3。培养基中均添加质量体积分数为3%的蔗糖和0.55%的琼脂，调整pH值至5.8。待愈伤组织长到直径约2 cm时，将其转移至上述不定芽分化诱导培养基中，每个培养瓶转接一个愈伤组织。每个处理重复3次。

1.2.4根的诱导

以1/2 MS作为基本培养，分别添加浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L的IBA，培养基中添加质量体积分数为2%的蔗糖和0.55%的琼脂，调整pH值至5.8。待分化芽生长至1.5～2.0 cm时，沿茎基部将其从愈伤组织切离，转接至上述生根诱导培养基中。

处理重复3次，温度为（24±1）℃，相对湿度为60%～65%，光源采用日光灯，光照时长为16 h/d黑暗，光照强度约为48μmol/（m2·s）。

1.2.5数据统计与分析

用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0对试验数据进行方差分析和Duncan法多重比较分析污染率、褐化率、存活率和生根率的计算公式如下:

公式

2、结果与分析

2.1胡杨花芽外植体的消毒灭菌

从表1可以看出，消毒剂不同，消毒时间也不同；随消毒处理时间的增加，污染率逐渐下降，而外植体致死率逐渐上升。就灭菌效果来看，70%乙醇30 s+8%次氯酸钠灭菌2、3 min和4 min效果均较好，但随着时间的延长，褐化率增高；70%乙醇30 s灭菌效果最差，对植物组织的危害最小；70%乙醇30 s+8%次氯酸钠灭菌2 min效果好。乙醇处理时间延长在一定程度上降低了外植体的污染率却使植物材料的褐化率增加，不利于花药的组织培养。

表1不同消毒药剂对外植体消毒效果比较

2.2愈伤组织的诱导

花药接种后约35 d，开始观察到愈伤组织形成，这些愈伤组织质地紧实，淡黄色不透明，表面有光泽，呈颗粒状，生长缓慢（图1a）。多重比较显示（表2）各个处理组合中愈伤组织的诱导率有显著差异（P<0.05），处理C11(1.0 mg/L NAA和1.0 mg/L BA）培养基中愈伤组织形成率最高，处理C16(1.5 mg/L NAA和1.5 mg/L BA）和C12(1.0 mg/L NAA和1.5 mg/L BA）次之。处理C12、C6和C10间没有显著差异。处理C1作为对照，未观察到有愈伤组织形成；处理C2、C3、C4、C5、C9、C13中只添加植物生长素或细胞分裂素的培养基中无愈伤组织形成。

图1胡杨花药诱导体系

表2植物生长调节物质对胡杨花药培养诱导愈伤组织的作用

其中处理C6、C7、C8、C10、C12、C14和C15虽然同时添加了植物生长素和细胞分裂素，但是愈伤诱导率极低。结果表明胡杨花药培养过程中愈伤组织的诱导需要同时使用植物生长素和细胞分裂素，且两者的比例和浓度合适才能高效获得愈伤组织。

2.3不定芽的分化

愈伤组织转接到分化培养基后，其颜色由黄色转为黄绿色继而变为绿色（图1b），转接到分化培养基后约20 d，在愈伤组织的顶端部位开始观察到有密集的绿色芽点出现，接着叶片伸展出来。数据分析结果显示（表3），添加不同植物生长调节剂组合的培养基中不定芽的生长情况差别较大。

处理S7(1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L BA+0.10 mg/L GA3）培养基中愈伤分化率最高，可达50%，分化植株长势最好（图1c）。处理S2、S3、S4、S5和S9都只获得了少量的分化植株，除S9分化植株长势较好外，其余处理得到的分化植株长势较差。另外处理S6、S8和对照S1均没有获得分化植株。以上数据显示没有添加GA3的配方未能成功诱导不定芽的形成。只有处理S7的配方诱导得到的不定芽长势较好，数量多。

表3植物生长调节物质对胡杨花药培养愈伤组织分化的影响

2.4根的诱导

不定芽接种到生根培养基中20 d左右，在添加有0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L IBA的1/2 MS生根培养基中，逐渐观察到根系形成。从表4可见：各处理下的生根率均极高，分别为90.0%、90.0%、96.7%和93.3%。其中添加了1.2 mg/L IBA的试验处理R4中，不定芽的根系长势最好，主根发达，侧根较多，植株健壮（图1d-f）。而对照组R1，培养基中没有添加IBA，不定芽未生根。

表4植物生长调节物质对胡杨生根的作用

3、结论与讨论

试验结果表明，高效胡杨花药再生体系为：消毒灭菌步骤为70%乙醇浸泡30s,8%的次氯酸钠浸泡2 min，无菌水清洗3遍；愈伤诱导培养基为H培养基+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L BA+5.5 mg/L琼脂+30 mg/L蔗糖；分化诱导培养基为MS培养基+1.0 mg/L NAA+0.2 mg/L BA+5.5 mg/L琼脂+30 mg/L蔗糖；生根培养基为添加了1.2 mg/L IBA+5.5 mg/L琼脂+20 mg/L蔗糖的1/2MS培养基。

胡杨是木本植物，其花芽分化始于当年夏季，直至次年春季才能发育完全进入开花期，花芽在发育过程中，积累了大量细菌，且花芽外部形态复杂，鳞片层数较多，相比于茎和叶消毒灭菌的难度更大。消毒灭菌的基本原则是既要将材料上附着的微生物杀死，又希望尽可能的减少对外植体的损伤，所以使用消毒剂的种类、浓度及处理时间需要根据外植体对消毒剂的敏感程度和灭菌效果来决定[18]。

有研究使用升汞作为消毒剂[19,20]，升汞是利用重金属汞离子来进行灭菌，它的灭菌效果极好，但是对植物组织的损伤非常严重[21]。70%乙醇比其他浓度的乙醇具有更强的穿透力和杀菌力，而且能使植物材料表面湿润以便于消毒剂的渗透[22]。本研究中使用苞片层数较多且形态复杂的花芽内的花药作为外植体，结果表明70%乙醇处理30 s和8%次氯酸钠处理2 min消毒效果最佳。

培养基成分是诱导愈伤组织形成的重要因素之一，其中氮源起了关键的作用。根据不同的物种或基因型，不同的氮源种类或浓度影响了愈伤组织的诱导。在小麦（Triticum aestivum）、水稻（Oryza sativa）、百合（Lilium brownii var.viridulum）及菠菜（Spinacia oleracea）中，研究者通过降低铵离子的浓度来提高愈伤增长比率[23,24]。此外，铁盐是培养基中最重要的组成部分之一。烟草中有研究表明，其胚胎分裂的起始是独立于铁离子的[25]；在添加0～30μmol/L的FeNaEDTA培养基中仅形成球形胚，而在添加了40～150μmol/L的FeNaEDTA条件下产生了完整的植株[26]。添加铁盐还会诱导花药壁的衰老[27]，这是许多物种中测定花粉植物诱导的一个重要因素[28]。

外源植物生长调节物质对花药培养过程中愈伤组织的诱导有着重要的意义，添加浓度的高低取决于植物内源激素的水平[29]。植物生长素和细胞分裂素共同作用提高愈伤组织形成率已经有诸多报道[30,31,32]。本研究中结果显示，添加1.0 mg/L NAA和1.0 mg/L BA的H基本培养基中愈伤组织的形成率最高，这表明一定浓度的生长素和细胞分裂素共同作用有利于杨树花药培养过程中愈伤组织的形成。

本研究结果显示GA3有利于胡杨不定芽的诱导及伸长，此现象在其他植物中也有发现。在黄荆的不定芽诱导过程中，培养基添加2.0 mg/L BA和0.4 mg/L GA3时，不定芽的诱导率显著提高，节间明显伸长[33]。研究表明GA和生长素相互作用一起调控植物茎的伸长，其中顶端衍生的生长素调节了GA的合成[34]。GA能够促进多种植物的不定芽分化和节间发育，例如拟南芥（Arabidopsis thaliana)[35]、罗勒属（Ocimum)[36]和栎属（Quercus)[37]。

生根培养基配方中一般不加细胞分裂素，仅添加IBA或者NAA[38,39,40]。前人研究将花药培养获得的愈伤组织转接到含有0.02 mg/L NAA的1/2 MS培养基中，不定芽生根率最高可达90%[12]。本研究中，不定芽转接到含不同浓度IBA的1/2 MS生根培养基中都能成功生根，表明胡杨生根对生长素浓度不太敏感。不过当IBA浓度为1.2 mg/L时，诱导得到的植株生长健壮，主根较长，根毛多。因此选择该培养基为最适生根培养基配方。

本研究以胡杨花药为外植体，对花药培养的条件进行了初步探究，成功建立了高效再生体系。花药培养是诱导产生植物单倍体可靠的途径之一，以本研究为基础进一步开展更多优良基因型胡杨的花药培养试验，期望获得胡杨单倍体或双单倍体，为之后的育种和遗传研究提供理想的材料。

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基金:转基因生物新品种培育重大专项(2018ZX08020002-002-004)资助