林地土壤中的碳、氮元素是森林生态系统中极为重要的化学元素，对植物生长和物质循环有重要影响[1]。陕西秦岭林区是我国重要的天然林区之一，历史上一直是建筑用材林基地[2]。但由于20世纪连续采伐，导致目前林分蓄积量低，土壤肥力低下[3,4]。土壤动物能显著提高土壤肥力[5]，蚯蚓作为大型土壤动物，分布十分广泛，是生态系统中重要的物质分解者，被称为“生态系统的工程师”[6]。在森林生态系统中，蚯蚓以枯枝落叶为能源进行自身的代谢活动，其通过取食、消化、排泄和掘穴等活动将凋落物粉碎，与土壤混合，加速凋落物的分解与转化，促进土壤养分循环[7,8]。

目前蚯蚓对土壤养分含量的影响存在异议：有研究发现蚯蚓活动可显著提高土壤有机碳含量[9]，促进有机氮的矿化[10]，增加土壤中无机氮的浓度[11,12]，但在连续培养实验中，有研究表明蚯蚓活动对土壤有机碳和全氮无显著影响[13]，另有研究表明蚯蚓活动对土壤硝态氮含量有显著提高，但铵态氮含量总体无显著影响[14]。秦岭中山地带广泛分布有锐齿栎（Quercus aliena var.acutesrrata）林、油松（Pinus tabulaefomis）林和松栎混交林，在提供木材、固土保肥等方面为我国的可持续发展发挥着重要的生态作用。自然环境条件下难以控制温湿度等因素对蚯蚓活性的影响，为保证蚯蚓在最适环境条件下生长，本研究选取秦岭林区3种典型林分锐齿栎林、油松林和松栎混交林作为研究对象，采用室内微宇宙方法控制实验环境条件，探究蚯蚓对林地内土壤碳氮含量的影响，以明确蚯蚓与土壤养分循环的关系。

1、材料与方法

1.1研究区概况

试验样地设在陕西秦岭森林生态系统国家野外科学研究站（33°18′～33°28′N,109°20′～109°29′E），该研究区位于秦岭南坡，地处北亚热带和暖温带的过渡带，海拔1 500～2 450 m，坡度多在30°左右，年降水量900～1 200 mm，相对湿度77.1%，年均气温8～10℃。土壤为山地棕壤，土层厚度为30～50 cm，凋落物厚度2～6 cm。研究区中优势树种为油松（Pinus tabulaefomis）、华山松（Pinus armandii）和锐齿栎（Quercus aliena var.acutesrrata），平均林龄42 a，林下植被发育良好，灌木草本种类丰富。试验样地选择在研究区内海拔1 554～1 585 m处的立地条件相似的典型林分内。

1.2蚯蚓的获取及鉴定

2017年7月在研究区内选取锐齿栎林（RCL）、油松林（YS）、松栎混交林（SLH）这3种典型天然林林分作为研究对象，每种林分选择3个大小为20 m×20 m的试验样地，在每个样地中按“对角线”设置5个2 m×2 m的样方，共45个样方。采用手拣法获取蚯蚓：在样方中心挖掘一个表面积25 cm×25 cm，深20 cm的土壤块，将土壤块中的蚯蚓拣出来[15]，将采集的蚯蚓称重带回实验室用于鉴定。在奥林巴斯SZX16立体显微镜下观察带回蚯蚓的大小和颜色，确定蚯蚓所在的科；然后数环节数，确定生殖带位置，性突起的特点，口器特点，雄孔和雌孔位置，刚毛特征，进而确定蚯蚓的属种[16]。经鉴定样地内蚯蚓为表居型爱胜蚓属的赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）。

由于实验所需蚯蚓数量较大，且采样期间天气温度高，长途运输会导致大量蚯蚓死亡，蚯蚓若全部采用手拣法获取难以实现，故在陕西省大荔县农场购买相同种属的蚯蚓，将其养殖在室外空地中，确保其正常生长，为室内培养提供充足的供给。

1.3样品的采集与处理

1.3.1土壤样品的采集

2017年8月采集各个林分的土壤样品。在45个样方中分别采用分层（0～10 cm,10～20 cm）多点混合取土法采集土样，共90份。并在每个林分中挖取1个土壤剖面，用环刀按层采样，用于测定土壤容重。将样地内相同土层的样品充分混合，装入自封袋中并编号，用保温盒带回实验室后分成两份，一份鲜样过2 mm筛，保存于4℃冰箱中，用于含水率的测定；另一份自然风干后过100目筛，测量样地土壤的基础理化性质（表1）。

表1土壤基础理化性质

1.3.2凋落物样品的采集

于2017年8月，在45个样方中放置25 cm×25 cm铁丝框用于收集凋落物，按未分解、半分解2层收集地表凋落物，并将不同采样点采集的处于相同分解状态的样品混合，共90份，编号带回实验室。取部分样品80℃烘干、粉碎过60目筛，用于凋落物有机碳、全氮、纤维素、木质素含量的测定（表2）。

表2凋落物理化性质

1.3.3样品预处理

将采集的凋落物自然状态下风干，撕成1～2 cm2的碎片，根据3种林分的凋落物年输入量，以及各林分中半分解和未分解凋落物的比例[17]计算加入的凋落物质量（表3），装入网孔为200目的尼龙网布中，喷水处理后，放入E-36VL人工气候箱中，25℃下腐烂分解20 d，供实验过程中蚯蚓食用。将每个林分的土壤用氯仿熏蒸以去除其他土壤动物和微生物，用四分法混匀，根据土壤容重计算加入微宇宙中的土壤质量（表3）。在实验开始的前2 d，将大小为0.2～0.3 g的未出现环带、生长状况良好的表居型赤子爱胜蚓，放置在底部铺有湿滤纸的培养皿中，将其保存在15℃的气候室中，进行48 h的清肠实验[18]。

表3微宇宙实验

1.4实验设计

蚯蚓在室内的培养实验采用微宇宙法[18]。本试验所用容器为直径12 cm、高10 cm、底部有透水孔的圆柱形塑料盆，将预分解的凋落物与土壤混合后放入微宇宙中，每个微宇宙中放入4条赤子爱胜蚓。

实验共3组：第1组锐齿栎林土壤+凋落物；第2组油松林土壤+凋落物；第3组松栎混交林土壤+凋落物。每组设接种蚯蚓（E）和无蚯蚓（ck)2个处理，每个处理设3个重复，共90个微宇宙。将装好的微宇宙置于温度22℃、湿度70%、光照时间为12 h的E-36VL人工气候箱中，用200目的尼龙网布封住小花盆，防止蚯蚓逃逸。每2 d调节土壤含水率至25%（在田间试验条件下获得的蚯蚓最适湿度），实验所用水均为蒸馏水。在实验开始后的第5、10、20、35、60天进行5次破坏性取样[18]，将土壤中的蚯蚓和剩余凋落物分离出来，土壤样品有机碳的测定采用重铬酸钾外加热法；土壤全氮的测定采用凯氏定氮法；土壤铵态氮硝态氮含量测定采用连续流动分析仪（CFA)[19]。

1.5数据处理

氮矿化速率（mg/（kg·d））计算公式为：

公式

实验数据处理和图表制作采用Origin 8.0软件，用SPSS 19进行数据分析与处理，并适当的进行图表制作。采用单因素方差分析（One-way ANO）和最小显著差异法（LSD）检验不同时间、不同林分土壤有机碳、全氮、碳氮比以及氮矿化速率之间的差异（P<0.05）。

2、结果与分析

2.1蚯蚓活动对土壤有机碳、全氮、碳氮比的影响

对锐齿栎、油松、松栎混交林3种林分的土壤有机碳含量进行分析，结果表明：在培养的第10天，锐齿栎和油松两组的E处理土壤有机碳含量均显著增加（P<0.05），随着培养时间的增加，有机碳含量趋于稳定；锐齿栎林ck处理有机碳含量有显著的上下波动（P<0.05），而油松林ck处理的有机碳含量呈显著下降趋势（P<0.05）。松栎混交林E处理的土壤有机碳含量增加，但无显著性变化（P>0.05），而ck处理土壤有机碳含量呈显著下降趋势（P<0.05）（表4）。在整个试验过程中，3种林分土壤有机碳的含量大小为：锐齿栎林>松栎混交林>油松林，这可能是由于锐齿栎凋落物较油松凋落物更易分解。在第10天开始，3种林分E处理土壤有机碳的含量开始大于ck处理，两处理间的最大差值为6.33 g/kg（锐齿栎）、16.87 g/kg（油松）、10.28 g/kg（松栎混交林），这表明蚯蚓活动对土壤有机碳含量的提高有一定的作用。在第60天时，油松林和松栎混交林土壤有机碳含量出现下降趋势，而锐齿栎林含量虽有增加，但增加幅度也较之前大大减小，原因可能是添加的凋落物总量减少，蚯蚓吞食大量土壤有机质，造成土壤有机碳含量减少。3个林分的土壤全氮含量变化与有机碳含量变化趋势相似。通过蚯蚓的活动，锐齿栎林和油松林的E处理土壤全氮含量显著性增加（P<0.05）并维持稳定，在第10天时锐齿栎林2种处理间的差值达到最大值为0.57 g/kg，油松林在第60天时达到最大差值为0.88 g/kg；松栎混交林中E处理土壤全氮含量也高于ck处理，且在第20天时两处理间差值达到最大。这充分表明蚯蚓的活动对土壤全氮含量有一定的积极作用（表4）。3种林分ck处理的土壤碳氮比均表现出随时间的增加而显著增大（P<0.05）的趋势，而E处理与ck处理相比较，蚯蚓活动维持了3种林分土壤碳氮比的稳定，随时间的增加，碳氮比只存在轻微地波动，并没有产生显著性的差异（P>0.05）（表4）。

表4不同林分土壤有机碳、全氮含量和碳氮比

2.2蚯蚓活动对土壤无机态氮的影响

蚯蚓活动对3种林分土壤硝态氮含量的影响相似，均随培养时间的延长而显著性增加（P<0.05）（图1），但油松林ck处理呈现显著下降趋势。在培养时间为60 d时，3种林分E处理土壤中的硝态氮含量达到最大值，与ck处理间的含量差值均达到最大，这表明蚯蚓活动可以促进土壤硝态氮含量的增加。

图1不同林分土壤硝态氮、铵态氮、无机态氮

从实验结果来看，蚯蚓对3种林分土壤铵态氮含量的影响均表现为先显著增加后显著降低的变化趋势（P<0.05），且在培养时间为35 d后，含量趋于稳定（图1）。3种林分E处理土壤铵态氮的含量在第10天时达到最大值，较第5天相比，分别增加了60倍（锐齿栎）、16倍（油松）、10倍（松林混交林）；之后开始减少，在第20天后土壤铵态氮含量开始慢速减少，趋于稳定。

由图1可知，3种林分E处理无机态氮含量随着时间的增加而上升，且差异显著（P<0.05），而ck处理无机态氮含量变化趋势较复杂（图1）。锐齿栎林两处理的无机态氮含量均随时间的延长发生显著性增加，较第5天相比，由于蚯蚓的作用，第60天时E处理增加量是ck处理增加量的2.6倍；而油松林和松栎混交林ck处理的无机态氮含量整体呈现显著减少的变化（图1）。蚯蚓通过对凋落物的取食及自身的分解转化，均提高了森林土壤中无机态氮的含量，蚯蚓活动对森林土壤无机态氮表现为积极作用。

2.3蚯蚓活动对土壤净氮矿化速率的影响

蚯蚓活动对3种林分土壤氮的矿化速率均有显著的提高（P<0.05），但每种林分土壤的净氮矿化速率随时间的变化趋势却略有不同（图2）。锐齿栎林在培养过程中E处理均表现为对氮的矿化，在第5、20、60天时，E处理的矿化速率高于ck处理，在第20天时，对氮的矿化达到最大速率3.91 mg/（kg·d）（图2）。油松林由于蚯蚓的活动整体表现为提高了土壤氮的矿化，在实验期间E处理呈现先增加后降低又增加的趋势，由第5天的1.35 mg/（kg·d）增加至第10天的2.39mg/（kg·d），增加了将近1倍，第35天时下降至0.52 mg/（kg·d），下降了78%，而后又开始上升；而ck处理的净氮矿化速率在试验前10 d呈快速下降趋势，在培养时间为10 d后开始表现为对氮的固定，第20天时净氮矿化速率达到最小值-2.20 mg/（kg·d）。松栎混交林E处理土壤的净氮矿化速率变化趋势与油松林类似，培养时间为20 d时净氮矿化速率达到最大值2.72 mg/（kg·d),ck处理在5,10,20,60 d均表现为对氮的固定，35 d时表现为对氮的矿化（图2）。

图2不同林分土壤净氮矿化速率

3、结论与讨论

蚯蚓主要依赖凋落物和土壤中的有机物质为食物来源，经过60 d的室内培养，本研究表明蚯蚓可显著提高土壤有机碳、全氮含量。一方面蚯蚓在土壤中的挖掘行为疏松和混匀了土壤，改善了土壤结构，使土壤孔隙度增加[20]，为微生物的生长提供了充足的空间，并且蚯蚓对凋落物的破碎作用减小了凋落物的尺寸，进而增大微生物在凋落物上的附着表面积[21]，有利于凋落物的快速分解，提高了土壤有机碳和全氮含量；另一方面蚯蚓以凋落物为食，并通过自身呼吸代谢释放CO2，但其同化效率较低（5%左右）[22]，取食的大部分凋落物以蚓粪的形式转变为土壤有机碳[23]，从而维持了土壤碳素的稳定，土壤碳素的稳定保证了土壤氮素的稳定[24]。随着实验的进行，微宇宙中凋落物总量减少，但蚯蚓仍需消耗有机物质来维持生命活动[25]，使得土壤中的碳氮含量在60 d时略有减少。在张雄春等[26]关于赤子爱胜蚓对土壤元素含量影响的研究中发现蚯蚓活动可以提高土壤全氮含量，且呈现随培养时间的增加而上升的趋势，这与本研究的前期结果一致，但由于其研究持续时间短，只进行了12 d，并未得到全面的结果，而本研究后期得到的结果更加充分地证明了蚯蚓活动对土壤碳氮的影响。但在陈平等[13]连续8周培养实验中蚯蚓并未对油松林土壤有机碳产生显著影响，这可能是蚯蚓种类、大小有关，本实验所用蚯蚓为未出现生殖环带的幼年赤子爱胜蚓，其研究所用蚯蚓均为带有生殖环带的成年威廉环毛蚓（Pheretima guillelmi）。与本实验研究结果相反的是Lubbers等[25]通过微宇宙实验研究表明，蚯蚓生命活动会消耗大量有机质，并使环境中的土壤有机碳减少，这可能与添加的凋落物类型、试验时间有关。

蚯蚓不仅可以通过自身代谢活动向土壤中释放氮素，还可以与其他土壤生物之间相互作用释放矿质氮[13]。蚯蚓挖掘洞穴、取食凋落物等活动加速了凋落物与土壤的混合，从而提高了微生物活性[27]，进而促进矿质氮释放；其次由于蚯蚓肠道中的厌氧环境以及可利用凋落物的增加刺激了反硝化细菌的活性[28]，从而提高矿质氮含量；蚯蚓活动形成的洞穴为硝化细菌和反硝化细菌提供生长发育的空间，提高了硝化速率和反硝化速率[29]，硝化细菌的增加使大量的铵态氮被氧化为硝酸，导致试验后期铵态氮含量的降低。然而在培养期间锐齿栎和油松这2种林分的ck处理中土壤硝态氮出现不同的趋势，这是由于添加的油松凋落物的C/N（表2）明显大于油松土壤（表1），微生物可利用的碳源增多，而氮源不足[30]，微生物需要吸收和固持土壤中原有的矿质氮以维持自身生长和繁殖过程中的碳氮平衡，致使油松土壤中的硝态氮在培养期间出现降低的现象[31]。而锐齿栎凋落物的C/N与土壤相差甚微，因此仅在培养初期出现土壤硝态氮降低现象，随着有机物矿化不断进行，碳不断被释放而减少，土壤总C/N降低到较低水平时，被微生物固持的氮素开始释放出来，土壤硝态氮含量升高。整体来看，3种林分不同时间段的E处理土壤硝态氮含量比ck处理都高，而且E处理土壤硝态氮含量呈显著增加趋势，体现了蚯蚓活动对土壤氮素矿化-硝化的积极作用。

蚯蚓通过掘穴、取食有机质及自身的分解转化作用，显著增加了锐齿栎林、油松林和松栎混交林3种林分土壤中的有机碳、全氮含量，并维持了C/N的稳定性，同时显著提高了森林土壤中的硝态氮、无机态氮含量，加快了净氮矿化速率，提高了土壤供氮能力，对土壤养分循环表现出一定的积极作用。然而，蚯蚓活动对土壤养分的影响还可能受到蚯蚓种群密度、种类等因素干扰，在后续的研究中应进一步探究这些因素与蚯蚓活动对土壤养分影响大小的关系，从而全面系统的总结蚯蚓对土壤肥力的影响。

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基金:国家林业科技创新项目(No.2017YFD0600504-2)资助