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探究关于牛大力的组织培养技术

2020-06-09 287 上传者：管理员

摘要：本试验通过组织培养手段，以牛大力种子为材料，对外植体诱导及无菌组织培养进行了尝试，以期获得牛大力外植体诱导、增殖和生根的适宜培养基和培养条件。结果表明，消毒方式为75%酒精消毒30s+0.1%氯化汞消毒15min，外植体诱导培养基为改良1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂6g/L+6-BA0.4mg/L+NAA0.15mg/L+益培灵0.20g/L，增殖培养基为改良MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.6mg/L+NAA0.20mg/L+益培灵0.10g/L，生根培养基为改良1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂6g/L+IBA1.5mg/L+ABT11.5mg/L+益培灵0.05g/L，较适宜牛大力组织培养。

关键词：
作物品种
外植体
牛大力
组培快繁
组织培养
药食两用
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牛大力，学名崖豆藤，豆科崖豆藤属植物[1]。牛大力性味甘、平，具有补虚润肺、强筋活络的功效，药食两用，是生产多种中成药的主原料。近年来，随着市场需求的增加，牛大力野生资源日趋枯竭，其育苗培养主要通过播种育苗和扦插育苗的方式[2]，以种子为外植体材料进行牛大力组培快繁的研究鲜有报道。本试验采用野生牛大力种子为外植体，开展组织培养技术研究，以期建立组织培养体系，为野生牛大力组培快繁提供参考[3]。

1、材料与方法

1.1试验材料

供试牛大力种源来自于广西宁明县，采收成熟的新鲜野生荚果种子。

试验所用的组培高效抑菌剂———益培灵购自上海宇涵生物科技有限公司，是一种新型组织培养专用防污染杀菌剂。益培灵抑菌剂的作用机理是穿透微生物的细胞壁进入细胞内部，通过干扰复制或断开微生物关键蛋白质的键而发挥杀菌作用。

1.2试验设计

试验设计见表1，每个处理3次重复，每个重复接种100粒牛大力种子，数据取3次以上平均数。试验中所用的外植体诱导、增殖和生根培养基pH值均为5.5～5.6，在121℃高温下灭菌15min，冷却后备用。试验选择新鲜饱满的种子作外植体，用饱和洗衣粉溶液刷洗干净，灭菌后接种到培养基上培养。无菌体培养条件为光强3000lx、温度25℃。

表1牛大力组培试验设计

2、结果与分析

2.1外植体消毒

试验结果表明，污染率与消毒处理时间成反比，灼伤率则与消毒处理时间成正比。其中，处理A污染率最高，分别是处理D、C、B的3.1、2.3、1.4倍；灼伤率最低，处理B、C、D分别是处理A的1.8、2.6、6.2倍（表2）。根据试验结果可知，灭菌方式C最为适宜，污染率和灼伤率均在最佳范围。灼伤率过高时，褐化现象严重，甚至抑制种子的萌发。在实际操作中，可将15min灭菌过程分作2次8min灭菌，中间用无菌水清洗数次，对灭菌效果影响不大，且对褐化、灼伤现象有较明显的抑制作用。

表2不同外植体消毒时间对牛大力组培的影响

2.2外植体诱导阶段

试验结果表明，外植体诱导阶段处理B萌芽率为90%，效果最好，分别较处理A、C、D高出12.5%、26.8%和38.5%;4个处理污染率无显著差异，平均污染率为15%（表3）。说明在低浓度时，萌芽率与6-BA+NAA浓度成正比；超过一定的浓度，萌芽率则随浓度升高呈下降趋势，且浓度过高时，牛大力芽苗纤细、生长缓慢、出现叶片黄化现象，并伴随愈伤组织异常。

表3不同处理对外植体诱导的影响

2.3增殖培养阶段

由表4可知，在牛大力增殖培养阶段，在6-BA+NAA低浓度时增殖倍数随浓度升高呈现出递增趋势，超过一定浓度则为递减趋势。增殖培养阶段处理B增殖倍数为5.8，有效芽最多，茎轴健壮，复叶翠绿，为最佳培养基配比。处理D增殖倍数最低，分别较处理A、B、C低14.3%、27.6%和17.6%。4个处理的污染率相差不大，平均值为8.2%。

表4不同处理对牛大力增殖培养的影响

2.4生根培养阶段

试验结果表明，生根培养阶段处理B最优，生根率为68%，根系健壮，侧根发达，较处理A、C、D生根率分别高出13.3%、15.3%和44.7%;4个处理污染率差异不大，均在6%左右（表5）。试验数据分析表明，在牛大力生根阶段，在低浓度时生根率随IBA+ABT1浓度升高呈现出递增的趋势，超过一定浓度后呈现出递减的趋势。

表5不同处理对牛大力生根培养的影响

3、结论与讨论

试验结果表明，消毒方式为75%酒精消毒30s+0.1%氯化汞消毒15min，诱导培养基为改良1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂6g/L+6-BA0.4mg/L+NAA0.15mg/L+益培灵0.20g/L，增殖培养基为改良MS+蔗糖30g/L+琼脂6g/L+6-BA0.6mg/L+NAA0.20mg/L+益培灵0.10g/L，生根培养基为改良1/2MS+蔗糖15g/L+琼脂6g/L+IBA1.5mg/L+ABT11.5mg/L+益培灵0.05g/L时，培养效果较好。新鲜的牛大力种子萌发率最高，当天剥开果壳的种子萌动快、发芽率高且污染率低[4]。不同浓度激素对野生牛大力组培各阶段都有显著影响，均表现为低浓度时促进、超过一定浓度后抑制。浓度配比适宜时，苗木健壮，叶片翠绿，生长迅速，有效芽多；激素浓度过高，则多发生畸形、玻璃化等现象，易形成白色松散的愈伤团；激素浓度过低，又影响萌动，这与相思树等其他树种的组织培养有相似性[5]。牛大力是木质藤本植物，在本试验中，生根率最高仅为68%，这与其他研究结果类似[1,6]。因此，牛大力生根培养适宜的生长素种类及最佳浓度配比，还有待进一步的研究。

传统中药材牛大力食药兼用，在药理研究中，具有保护和修复辐射损伤、调节免疫功能、护肝、祛痰、平喘等功能[7,8]。其化学成分分析显示，牛大力富含黄酮类化合物、多糖及多种微量元素，具有药源充足、疗效显著、毒副作用较小、不易产生耐药性等优点，具有相当广阔的应用前景[9,10,11]。近年来，牛大力野生资源遭到了极大的破坏，几近枯竭，利用组织培养技术进行牛大力快繁具有重要的意义，有待于进一步的研究深入，完善技术体系，在理论和生产上提供技术参考。

参考文献：

[1]潘颖南,张向军,蒙平,等.药用植物牛大力组织培养初探[J].广西农业科技,2010,41(6):523-525.

[2]黎瑞汝,陈占科,高珊,等.中药牛大力的研究进展[J].亚太传统医药,2010,12(6):164-168.

[3]时群,陈丽文,陈乃明,等.牛大力种子组培快繁技术研究[J].安徽农业科学,2011,44(21):138-141.

[4]李冬萍.中药材牛大力离体培养与繁育的研究[D].南宁:广西大学,2013.

[5]蔡玲,王以红,吴幼媚,等.五种相思树组织培养研究[J].广西林业科学,2003,32(1):27-29.

[6]黄碧兰,徐立,李志英,等.牛大力茎段组织培养技术研究[J].安徽农业科学,2008,36(32):93-94.

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[9]陈黄保.甜牛大力和苦牛大力的生药研究[J].中草药,2001,32(9):843-845.

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[11]杨民胜,李天会.中国桉树研究现状与科学经营[J].桉树科技,2005,22(2):1-6.