浙江省属经济发达省份，但其山区面积达到717万hm2，占全省土地面积的70.4%，山区县市是经济发展相对缓慢的地区[1]。因此大力发展山区经济是浙江省经济发展的重要部分。浙江省衢州市开化县为典型的山区县，生态环境优越，具有丰富的茶树资源[2]。茶树是我国经济效益较高的作物[3]，对大力发展山区经济，具有良好的效果。截至2013年，开化县已发展8000hm2高山茶园，春茶总产量1165t，产值达到4.22亿元[4]。但目前仍存在产品结构单一等问题限制了茶产业进一步的发展[5]。因此，收集开化县地区的茶树种质资源，研究其遗传背景和亲缘关系是未来培育新品种茶树，丰富茶类结构和茶产品，以及进一步提升茶产业的基础。

微卫星标记作为PCR技术分子标记的代表，在上世纪90年代末至21世纪初被广泛应用于各种作物的遗传研究中[6,7]。SSR是广泛分布于真核生物基因组中的重复DNA片段（1～6bp)[8]，具有共显性、多态性高、易检测、重现性好等优点，较之目前常用的SNP标记成本更为低廉，因此拥有极强的实用性[9]。目前，SSR标记已广泛应用于茶树的遗传多样性和遗传图谱等方面的研究[10,11]。王松琳等[12]利用62个SSR标记分析了白化和黄化茶树资源的遗传多样性，并初步明确SSR标记在此类茶树资源的适用性；王让剑等[13]采用荧光标记的SSR建立了54个福建无性系茶树品种的鉴别图，实现品种的快速、稳定鉴别。Chang等[14]结合SSR、RAPD和AFLP标记对79个单株的F1群体建立了1份包含309个标记的遗传图谱；徐礼羿等[15]利用SSR标记构建的遗传图谱实现茶树炭疽病的QTL分析，成功挖掘了8个与茶树炭疽病相关的QTLs。

本研究通过15个SSR位点，分析浙江省开化县茶树资源的遗传多样性，旨在为开化县茶树资源构建SSR指纹图谱，筛选1组用于鉴别该地区种质资源的核心SSR标记，并检测其在指纹图谱中的检测能力，研究开化茶树资源的遗传背景，为后续新品种选育提供依据。

1、材料与方法

1.1材料

选取浙江省开化县的26份茶树资源作为试验材料，分别编号1—26，以种植于中国农业科学院茶叶研究所嵊州基地的10个育成品种作为对照材料，分别编号27—36。取其新鲜的幼嫩组织置于–20℃下保存。供试样品详细信息见表1。

1.2DNA提取

DNA提取使用改良CTAB法，待测样品的组织材料经液氮冷冻后，快速置于自动研磨仪中以30r·s-1的速度研磨2min，若材料未充分研磨可重新置于液氮中冷冻后再次研磨。研磨彻底的材料粉末采用植物基因组提取试剂盒（DP305PlantGenomicDNAKit，天根生化科技有限公司）提取DNA，详细提取方法参照试剂盒说明书。基因组提取后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，使用超微量分光光度计（NanoDropND-1000，赛默飞世尔）测定DNA的浓度和纯度；根据DNA的浓度将每份样品DNA稀释到20～30ng·μL-1，–20℃保存备用。

1.3候选SSR引物的PCR扩增

从课题组前期已构建完成的遗传图谱[16]上挑选多态性高、条带清晰的15对SSR引物（表2）对样品DNA进行PCR扩增。

PCR反应体系：ReactionMix5.0μL（含DNAPolymerase、2×PCRBuffer、MgCl2和dNTP）；模板DNA2.0μL;Primer-F、Primer-R(10ng·μL-1）各0.2μL，加ddH2O至10μL。

PCR循环参数：94℃预变性4min;94℃变性30s，最适退火温度退火30s,72℃延伸30s，共计35个循环；72℃延伸10min;4℃保存（根据各个引物合成信息，Tm为52～58℃）。

表136份供试样本信息表

1.4扩增产物的PAGE电泳和银染显色

扩增产物加入2μL上样缓冲液（6×LoadingBuffer）混匀，进行10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳在CBSMGV-202-33型垂直电泳仪上进行。电泳结束后进行银染显色，用Bio-RadGelDoc2000凝胶成像仪拍照，然后用保鲜膜将凝胶封存。

1.5数据处理

采用人工读带的方法，将电泳图上的目的片段范围内清晰的条带，按照分子量大小，从大到小依次记作A、B、C、D…，单一条带为纯合基因型，两条条带为杂合基因型，因条带的大小不同分别记录为AA、AB、BB、AC、AD、CD等，条带缺失记为“..”。得到的数据计入Excel表，建立起原始基因型数据矩阵。

表215对SSR引物信息

利用GenAlEx6.5.0.3软件[17]进行基因频率、杂合度、标记鉴别力等一系列遗传参数的运算。首先，将原始基因型数据矩阵格式化为软件所需的格式，Excel的第一行分别填写位点数、样本数、种群数及各个种群所含有的样本数；Excel第一列为样本编号，第二列为样本对应的种群名，第3列起为标记列，每个标记占2列，将等位位点分列，并将基因型A、B、C…替换为数字形式的1、2、3…，缺失位点用“0”表示。

按照供试样本的基因型数据，将其转换成PowerMarkerv3.25软件[18]要求的数据格式，例如基因型“AA,AB,BB…”转换为“1/1,1/2,2/2…”，缺失数据用“？”替代。基于“Nei.1983”计算样本间的遗传距离并进行UPGMA进化树构建。使用FigTreev1.2.4软件绘制UPGMA进化树。

将按照供试样本的基因型导入Cervus软件[19]进行亲缘分析，其中检测样本比例设定为0.95，检测位点设定为0.8，缺失位点设定为0.1。

2、结果与分析

2.1遗传多态性

本试验采用的14对SSR标记在26份开化茶树资源的样本中表现出中等水平的多态性，除标记CsFM1660(65%）以外，其余13对SSR标记均在超过88%的样本中能成功扩增出目的片段（图1，表3）。14个SSR标记共计扩增出58个等位基因，标记的等位位点范围为3～6个，平均每个SSR标记扩增出4.14个等位位点，平均有效等位位点数为2.927个。标记CsFM1781、CsFM1835和CsFM1843扩增的等位基因较少，仅为3个；标记CsFM1735扩增的等位基因最多，达到6个（表4）。所选用的SSR标记超过70%(10对）在样本组中具有鉴别出4个及以上等位基因的能力。

通过表3可以发现，本研究中SSR位点的有效位点数Ne与多态信息量I存在正相关，SSR位点拥有的有效等位位点数越多，其多态信息量越高。例如，在14个标记中，标记CsFM1735的有效等位位点数最多，达到4.380，其多态信息量（1.602）同样为所有标记中的峰值。与之相反的，CsFM1737在样本组中的有效等位位点数仅为1.688，为14个标记的最低值，其多态信息量（0.777）同样为样本组中的最低值。同时，本研究中CsFM1660、CsFM1671、CsFM1715、CsFM1735和CsFM1839等5个标记的有效标记数均超过3个，在样本组中表现出的多态性较高，具有较强的鉴别能力。此外，标记CsFM1640、CsFM1651、CsFM1671、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1717、CsFM1735、CsFM1737、CsFM1781、CsFM1835和CsFM1839等11个位点的观测杂合度均高于0.5，表明这些位点在样本组中呈现出中高度多样性的特点，可以选用这11个SSR标记作为本试验样本组遗传多样性分析的核心标记组合。

在CsFM1640、CsFM1651、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1735、CsFM1737和CsFM1835等7个位点中，固定系数F为负值，即Ho值略高于He值，表明在这些位点上存在轻微杂合子过量的情况。

2.2指纹图谱与标记的鉴别能力

利用GenAlEx软件，将基因分型数据进行复合位点分析。结果发现，基于14个SSR标记组合，36份供试样本的数字化基因分型如图2所示。本试验的14个SSR标记鉴别结果显示，编号17和18的两个样本具有相同的基因型，因此我们推测这两个样本的遗传背景相同。此外，我们进一步计算了复合位点的非同一概率值PE（表5）。PE-1表示位点未缺失时的PE值，PE-2表示缺失1个位点的PE值，PE-3表示去除1个纯合位点的PE值。由表5可知，14个SSR位点的PE-1值的范围在0.2121～0.5888，均值为0.4033;PE-2值的范围在0.0791～0.4098，均值为0.2440;PE-3值的范围在0.3527～0.7713，均值为0.5695；在位点未缺失的情况下，14个SSR位点组合后，两个随机样本基因型组合不同的概率值（PE-1）为0.9994；若缺失一个位点时，14个SSR位点组合后两个随机样本基因型组合不同的概率（PE-2）为0.9815；在去除一个纯合位点的情况下，14个SSR位点组合后两个随机样本基因型组合不同的概率（PE-3）为1.0000。

图1标记CsFM1715的部分电泳条带

表314对SSR标记的遗传参数

表414个SSR标记在36份供试样本中的位点频率与位点数

图236份供试样本数字化基因分型的条形码

基于表5可知，PE-1、PE-2和PE-3之间存在极显著正相关。由图3可知，随着SSR位点组合从1个增加到14个，样本组中随机2个样本具有不同基因型组合的概率值PE-1从0.4425上升为0.9994,PE-2从0.2596上升为0.9815,PE-3从0.5959上升为1.0000；因此，当我们选择10个核心SSR标记组合时，PE-1和PE-3分别超过0.99,PE-2超过0.95。为了能够用尽可能少的核心引物准确地识别本试验的种质资源，筛选出本试验中PE值排名前10的标记作为核心标记，包括CsFM1640、CsFM1651、CsFM1660、CsFM1671、CsFM1714、CsFM1715、CsFM1717、CsFM1735、CsFM1757和CsFM1839。

2.3亲缘分析

基于Nei’s遗传距离构建了36个供试样品的UPGMA进化树图（图4）。按遗传距离的远近，供试样品可大致分为3个类群（Group1、Group2和Group3）。Group1共有9个样本，包含1个育成品种龙井43，且样本KH-2015-13与龙井43遗传距离最近，推测其与龙井43亲缘关系较近；样本SZ-2和KH-2015-1之间遗传距离相同，推测其遗传背景极度近似或相同。Group2共有15个样本，包含乌牛早、白毫早、金萱、南江1号和农抗早等5个育成品种；海顺1号和海顺2号、KH-2015-14和KH-2015-15为2个遗传距离相等的组合，推测其遗传背景极度近似或相同。Group3共有12个样本，包含福鼎大白、迎霜、中黄1号和中黄2号等4个育成品种。

表514个SSR标记的PE值

图3不同标记组合数的PE值

基于UPGMA进化树划分的3个类群，分子方差分析（Analysisofmolecularvariance,AMOVA）结果显示（图5),14个SSR位点的基因型频率在样本中的分子变异表现出组间（8%）<组内（14%）<个体（78%），即按遗传距离对样本组进行分群可以发现，36份供试样本的分子遗传变异主要源于个体间。

采用Cervus软件对各个样本之间的亲缘关系进行模拟分析可知，在置信度水平为80%和95%时，其Δ阈值分别为1.00和1.25，即样本两两间的LOD值高于阈值时，表明二者存在该置信度水平下的亲子关系。由表6可知，样本SZ-2和KH-2015-1存在显著的亲子关系，且二者均与KH-2015-8存在亲子关系。此外，样本KH-2015-7和大龙黄化、KH-2015-11和KH-2015-22、KH-2015-18和KH-2015-19等3个组合存在亲子关系。

3、讨论

3.1SSR标记的多样性和检测能力

本研究采用的SSR标记源于Tan等[20]开发的分子标记，已广泛的应用于茶树资源的分子指纹图谱构建和遗传分析[21]。徐礼羿等[22]对勐库大叶种茶树进行SSR遗传分析后认为，8个核心SSR标记即可成功识别200份以上的试验材料。因此，本试验初期选取15个SSR标记进行多样性分析，结果显示共有14个SSR标记具有多态性，标记的等位位点3～6个，平均每个SSR标记扩增出4.14个等位位点，平均有效等位位点数为3.08个。除初期排除的1个标记外，14个SSR标记的多态信息量均较高（I>0.5），表明本研究选取的14个标记整体多态性较好，符合构建指纹图谱进行品种鉴定的要求。基于复合位点的非同一性分析发现，选择10个核心SSR标记组合时，PE-1和PE-3分别超过0.99,PE-2超过0.95，即可实现对本试验36份材料的成功识别。与Tan等[21]和徐礼羿等[22]的结果相比，本研究鉴定的材料较少，但需要增加2个核心标记才能实现资源的精确识别，结合亲缘分析和进化树图，推测样本之间亲缘关系较近是导致该现象的原因，因此后续有待进一步开发更适合此类资源鉴别的多态性标记，降低用于鉴定的核心标记数，提高性价比。

图436份供试样本的UPGMA进化树

图5基于UPGMA进化树分组样本的AMOVA分析

表636份样本的亲缘分析

3.236份材料的亲缘分析

本文基于Nei’s遗传距离将供试样本分为3个类群，Group1中的样品主要与对照品种龙井43的亲缘关系较近，其中KH-2015-13与龙井43的亲缘关系最为接近。此外，基于亲缘分析，Group1中样本SZ-2和KH-2015-1之间存在显著的亲子关系，且二者均与KH-2015-8存在亲子关系。由表1可知，SZ-2和KH-2015-8均种植于苏庄镇，而KH-2015-1种植于齐溪镇大龙村，结合三者的遗传分析和地理位置，推测SZ-2和KH-2015-8可能为KH-2015-1的父母本，KH-2015-1由苏庄镇引种至齐溪镇大龙村。

Group2中存在遗传距离相等的2个组合，海顺1号和海顺2号、KH-2015-14和KH-2015-15。其中，海顺1号和海顺2号表型特征接近，均为特异的白化种质资源（图6-A），在未来研究中，可用于优异白化品种的选育；基于KH-2015-14和KH-2015-15的基因分型可以发现，两个样本之间的14个标记基因分型完全相同，且两个样本表型相似，均有发芽特早的特点，推测两个样本源于同一亲本茶树。此外，Group2中KH-2015-18和KH-2015-19之间存在显著的亲子关系。

亲缘分析显示Group3中的样本组合KH-2015-7和大龙黄化、KH-2015-11和KH-2015-22存在显著的亲子关系。其中KH-2015-11和KH-2015-22均具有叶色黄绿的特征。此外，作为对照样本的10个育成品种分布于3个类群之中，除龙井43和中黄2号外，其余8个品种与26份开化的茶树种质资源遗传距离较远，表明开化的茶树资源具有区别于现有育成品种的遗传背景，遗传多样性丰富，这与表型观测结果一致。表型性状观测发现，开化的茶树种质资源中具有白化（图6-A）、黄化（图6-B）和紫化的特异种质资源，本研究结果对未来开化地区特异性状茶树种质资源的开发和选育具有重要意义。

图6海顺1号（A）和KH-2015-13(B）的表型特征

本研究基于14个SSR分子标记，分析浙江省开化县26份有性群体种茶树种质资源和10个育成茶树品种之间的亲缘关系，并构建SSR指纹图谱，进一步筛选出10个核心SSR位点作为简化的组合，在位点未缺失的情况下，识别率可达99%以上，在缺失1个位点的情况下，识别率也可达到95%；结合群体遗传结构分析，36份供试样本被分为3个类群，并初步推测样本组中存在亲子关系的5个组合。综上，本文分析了开化县26份茶树种质资源的遗传背景，为该地区未来新品种选育及种质资源保存提供了研究基础。

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基金:中央级科研院所基本科研业务费专项(1610212018004);国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目(CARS-19);浙江省农业新品种选育重大专项(2016C02053)