木质纤维素的高值化利用已经成为生物质可再生利用的重要途径[1]。在众多的生物质高值化利用的手段中，造纸是最为有价值的转化过程[2]。然而在造纸过程中，如何进一步减少能耗、水用量以及化学品消耗是造纸企业共同面对的挑战[3]。生物过程因其过程友好、条件温和、用水量少、选择性高等优点，一直以来都受到学界的关注[4]。但是生物过程因其自身的低效和不稳定性，限制了其广泛的应用。随着各国环境政策法规的不断规范和排放要求不断升高，生物技术又重新获得了学界的广泛关注。

尽管面对大量技术性难题，但是随着研发资金的投入，以及基因工程、分子生物学技术的进步，生物技术，尤其是利用漆酶的生物过程在制浆造纸过程的多个环节的应用，一定会有长足的进步[5]。因此，本文对近年来有关制浆造纸过程中使用漆酶以及辅助使用漆酶介体的应用进行初步的综述，从而总结前人的工作并发现存在的问题，以期为该领域的研究提供一定的参考。

1、漆酶概述和研究趋势

漆酶作为一种苯二酚氧化还原酶（EC1.10.3.2），因为拥有多个铜金属催化活性位点，具有可以催化降解多种芳香环有机物的功能。漆酶因最早被发现于日本的漆树而得名[6]。漆酶广泛地存在于具有腐化木材功能的真菌当中[7]。漆酶具有三个含铜的活性位点：一类Type1活性位点主要完成电子转移；二类Type2活性位点为氧原子活化位点；三类Type3位点完成氧原子吸附和传导。通常，在没有铜元素存在的条件下，漆酶将无法完成真正意义上的氧化还原反应。因此，铜元素在漆酶的活化活性中起着重要的作用[8]。

近年来的研究趋势表明，有关漆酶的报道和相关的应用型研究正在逐年增长。我们通过使用Scopus和Googlescholar的文献相关统计，对有关漆酶的研究领域大致地划分了五大类，即：医药相关领域（PT）、能源相关领域（EN）、农业与生命科学领域（AB）、分子生物学领域（BG）、化工相关领域（CE）。通过对发表论文的收集，对过去五年当中有关漆酶在这五大类中的报道进行了汇总。其结果如图1所示。

图1有关漆酶报道的不同文献和相关主题分类的统计分布

从图1中可以看出，在过去的五年中，在以上五个主要的研究领域，有关漆酶的文献量（每年）都在500篇以上。2019年虽刚刚过半，有关漆酶在以上五个领域的报道也已经接近400篇，这说明在2019年度，漆酶的研究仍然呈现稳中增长的趋势。从研究的领域看，漆酶在化工和分子生物学领域中的研究一直是研究重点。而在相关的化工过程的研究中，漆酶在制浆造纸过程中的作用以及其在环境控制方面的报道也是许多学者近期关注的热点。因此，我们将针对漆酶在制浆造纸工艺中的研究进行进一步地探讨。

2、漆酶在生物制浆过程中的应用

目前，工业上广泛采用的制浆方式主要分为机械制浆和化学制浆两种。机械制浆过程不仅能耗较高，通常情况下也无法脱除木质素，所得的纸浆的色度通常无法得到进一步的提高。化学制浆法虽然能够有效分离和脱除木质素，但是最重要的问题是在制浆过程中同时伴随黑液的产生。如果采用木浆造纸，黑液可以通过碱回收工段浓缩蒸发从而将蒸煮剂重新回收并将热能加以循环利用[11]。但是对于草浆造纸，由于灰分特别是有机硅的存在，不易实现碱的回收，从而使小规模草浆造纸厂产生大量的黑液[1,2]。

生物制浆过程作为一个重要的补充制浆技术，随着社会对环境友好制浆过程的关注增多，重新受到许多学者们的关注[12]。在生物制浆过程中，漆酶扮演着非常重要的角色。图2为生物制浆过程的简化流程。

图2  生物制浆过程简图

生物制浆过程总体来看可以分为以下的几个关键步骤：前处理过程（主要是去除许多影响生物活性的杂质）、接种和培养过程（该过程的核心）。在培养过程中，漆酶联合其他种类的氧化还原酶类催化剂催化木质纤维素进行氧化还原反应，将木质素为主的芳香环类的木质纤维素从高分子有机物逐渐降解为小分子可降解的化合物。这样为后续进行制浆过程节约了大量的化学品消耗，从而在整体上降低化学品消耗和相应的能耗，最终实现更加环保和低排放的制浆过程。表1列出了相关使用白霉菌以及其他菌类协助生物制浆过程的比较。

从表1中可以看出，不同菌株对于不同的生物质原料在制浆过程中所需要的条件有很大的不同。以培养pH为例，菌株PhlebiabrevisporaBAFC633（白腐真菌）可以维持在酸性条件下进行生长（pH=3.6）。物质中的木质素被大量有选择性地降解，同时少量的阿拉伯糖也被降解。与此同时，生物质中绝大多数碳水化合物被保留下来。对于使用专门降解木质素的微生物，以芦苇秆作为造纸原料进行接种培养，过程pH可以接近于7。从生物制浆过程的处理时间上来看，并未呈现出草浆处理时间明显少于木浆处理时间的现象。

这说明原材料三组分，即半纤维素、木质素和纤维素的组成成分对于使用漆酶进行降解木质素的过程不是唯一关键的影响要素，其他初始操作条件例如：生物质的破碎程度、接种量和菌株种类等都可能影响最终的处理时间。从培养温度上看，绝大多数培养温度都在23～30℃。通常，温度越高，漆酶处理制浆脱除木质素所需的相对时间越短。例如使用P.sanguineus菌株对松木进行脱除木质素的处理，在30℃下，处理时间仅需要14天。而在使用Basidiomycetes菌株对甜菜粕进行脱除木质素的处理中，在27℃下，处理时间需要长达60天。

另外，处理时间长短除了与处理温度有关外，使用的菌株以及pH条件对于脱除木质素的时间影响起着更为重要的作用。从如上的比较中可以看出：木质纤维素的生物质种类对于生物制浆过程的脱除木质素影响不明显，草浆例如甜菜粕的木质素脱除时间（60天）远远超过处理的木浆例如松树的处理时间（15天）。从不同菌株使用效果上来看，使用P.sanguineus菌株对松木进行脱除木质素的处理的效果最佳（pH=4.8下，30℃，处理时间仅需要14天）。在漆酶应用于生物制浆过程中，菌种的作用是最为关键的。如何培育和分离出更为有效生产漆酶的真菌或细菌微生物将是未来工作中非常重要的基础研究环节。

表1  生物制浆过程比较

3、漆酶在生物漂白中的应用

近年来，随着生物技术特别是对漆酶-介体系统研究的不断深入，利用漆酶-介体系统的高选择性、低污染性的特点进行生物漂白的研究受到广泛关注。漆酶生物漂白技术主要是利用漆酶对木质素的降解作用，从而达到脱色漂白的目的。虽然漆酶可以直接降解木质素的芳香环，但是漆酶无法有效氧化降解非芳香环类支链官能团，这也是单独使用漆酶进行生物漂白最大的限制因素。由于介体系统的引入，木质素中的支链官能团的活化能被有效降低，那些在单独使用漆酶无法降解的木质素结构在添加介体系统后，都可以被漆酶-介体复合系统有效降解。因此，漆酶-介体系统备受关注。

从表2可以得出，不同生物质对应的不同菌株所适配的介体系统有所不同，因而所需要的条件也有所区别。以木材类原料为例，处理云杉类、桉树类以及混合木材类原料通常只需要2h左右，反应的pH通常在4～6之间。但是在松树生物漂白过程的处理时间长达8h之久。其可能与原料中木质素的疏松紧密程度有密切的关系[27,28]。从pH的角度来说，生物漂白过程基本维持在酸性的条件下（pH=4.0～6.0），γ-proteobacteriumJB菌株配以ABTS处理麦秆是一个例外，其所需要的pH为8.0，偏碱性。此外各类菌株的培养温度基本相似，均为40～60℃。

研究表明，高温易使漆酶降解木质素的效率提高，即所需处理时间变短。介体对于处理条件的影响最为明显，例如使用Trametesvillosa菌株搭配HBT介体对桉树进行木质素降解，在50℃、pH=4.0的条件下，处理时间仅需2h。而对于使用Pycnoporuscinnabarinus菌株搭配乙酰丁香酮、丁香醛和对香豆酸介体对亚麻进行木质素降解，在相同温度和pH值的条件下，需要处理5h。当代主流的漆酶-介体系统所使用的介体为HBT，因为许多研究表明漆酶-HBT系统不仅能提高木材和非木材的纸浆漂白率以及木质素降解能力，并且能有效去除影响纸机运行效率的胶黏物，以达到优化纸浆性能的目的。

不同植物组织中的木质素种类对于生物漂白过程也存在着一定的影响。从以上比较可得出，使用Trametesvillosa-HBT系统对桉树进行木质素降解的处理效果最佳（pH=4.0下，50℃，处理时间仅需2h）。然而，漆酶-介体系统需要面临以下的技术问题：（1）如何研发出更不易影响漆酶稳定性的合成介体；（2）提高介体的重复利用率；（3）如何进一步缩短处理纸浆的生物漂白时间；（4）如何能够进一步降低纸浆生物漂白的处理温度。这样，才可能实现该过程在制浆造纸过程中的实质性应用。

表2  生物漂白过程比较

4、漆酶在树脂控制环节的应用

纸浆中除了纤维素、半纤维素和木质素外还含有少量其他种类的有机物，即植物组织中的树脂类化合物。由于残留的树脂会影响纸张的质量和制浆设备的运行效率，所以控制和去除纸浆中的树脂成为提高纸浆质量必不可少的一步[29]。漆酶具有选择性氧化酚醛类木质素结构和作用于纸浆中不饱和脂类物质的功能。但是其对通过低分子量烷烃类官能团作用有限。为了提高漆酶的作用范围，通常使用介体来提高漆酶的氧化还原电势，从而使漆酶能够作用于除酚醛类木质素结构以外的低分子量烷烃类官能团。因此，漆酶介体联合系统被广泛应用于纸浆树脂脱除阶段。表3比较了使用不用漆酶联合介体系统对纸浆树脂的脱除效果。

甾醇也称为固醇，是一类通过使用硫酸盐蒸煮桉树得到的亲脂化合物。CristinaValls等人在不同操作条件下使用漆酶介体对桉木浆中的甾醇去除进行了研究。此研究中漆酶剂量、介质剂量和反应时间都对木浆中甾醇的脱除产生了不同的影响。最适宜的条件是在漆酶浓度16μg/Lodp(Ozonedepletionpotential），中间剂浓度为0.5%odp，反应时间为4h时，纸浆中几乎所有游离甾醇都被清除，除了固醇外，纸浆中残留的木沥青或木树脂，也会对造纸机运行性能和产品质量产生负面影响。

因此，减少纸浆中木沥青或木树脂含量对成本和设备会有很大的保护作用。木沥青或木树脂主要由脂肪酸、树脂酸、甾醇酯和甘油三酯组成。T.villosa漆酶和T.hirsuta漆酶能够通过一定程度上在空间层面修饰脂肪酸和树脂酸，从而有效地达到处理木树脂的效果。使用气相色谱分析仪(GC-Gaschromatography)分析了工业亲脂性模型化合物的化学成分，结果表明松香油脂肪酸(TOFA-Talloilfattyacids)和松香油树脂酸分别含有约84%和59%的单体成分。而树脂酸又是由共轭树脂酸、海松酸、去氢松香酸、异松脂酸组成。StinaKarlsson等人使用T.hirsuta漆酶对纸浆中木树脂进行处理。结果表明，纸浆中共轭树脂酸含量明显减少约30%，而纸浆中海松酸和异松脂酸含量只下降了约3%。

与此同时，纸浆中的去氢松香酸反而升高了约10%，而由于气相色谱分析仪表示的结果已经发生了改性，对其产物的进一步分析还有待进行。可能的原因在于T.hirsuta漆酶在空间的选择性和反应活性对于不同的树脂酸显示出不同的效果。T.villosa漆酶对于纸浆中树脂酸的作用显示出与T.hirsuta漆酶较为类似的效果。T.villosa漆酶和T.hirsuta漆酶对于不同树脂酸表现出不同的选择性，可能的原因在于共轭树脂酸、海松酸、去氢松香酸、异松脂酸类在空间结构上的差异，从而导致酶在接近这些化合物的难易程度产生了不同。从选择性上看，纸浆中共轭树脂酸是最容易被T.villosa漆酶和T.hirsuta漆酶降解去除。而对于去氢松香酸的脱除，使用T.villosa漆酶和T.hirsuta漆酶无法达到脱除的效果。

表3  不同漆酶介体系统去除纸浆树脂

比较表3中使用的介体体系可以看出，1-HBT是大多数生物漆酶介体系统所选用的介质，而栓菌属也是大多数研究者选用来解决树脂障碍的菌属类。这主要是因为：（1)1-HBT体系能够最为有效地提高纸浆的亮度；（2）最为有效地降低纸浆的卡伯值；（3)1-HBT介体也是研究较为透彻的体系；（4）栓菌属通常培养相对简便和经济。除了树脂酸，其他类似树脂类物质包括碳化氢、其他类固醇、三萜烯类化合物和三酸甘油酯在内的亲脂类萃取物，也是广泛存在于纸浆中的另一大类树脂化合物。在这些树脂类化合物中，亲脂类因其抽出物相对容易，从而可以被绝大多数真菌有效降解。

固醇脂类化合物可以被一些子囊真菌有效降解；而非共轭固醇类的一些不易被微生物降解的化合物只能被某些担子菌类的白腐菌有效降解[35]。由于不同真菌菌类产生的漆酶具有降解不同树脂类化合物的特性，未来漆酶在纸浆树脂脱除的应用中，应该采取多种类漆酶联合使用的方法，从而使纸浆中的不同树脂能够脱除，更为有效地提高纸浆质量。从漆酶介体体系脱除纸浆中树脂的类型上看，目前针对利用漆酶介体体系对亲脂类萃取物降解的研究还非常有限，我们认为这也将是未来值得深入研究的方向。比较表3中的操作条件可以看出，不同漆酶介体体系反应温度有很大的不同（24～50℃）。研究显示，

Pycnoporuscinnabarinus菌类所需处理温度较低，而嗜热菌类例如Myceliophthorathermophilelaccase等对于处理纸浆中的树脂需要较高的温度（50℃）。使用不同的漆酶介体体系应该考虑到处理纸浆所具有的温度，如果纸浆在脱除树脂之前的温度较高，应该着重考虑使用嗜热菌类所产生的漆酶进行树脂脱除。除了温度以外，纸浆的pH值是另一个较为重要的操作参数。表3中pH值的波动范围在4～7之间，说明绝大多数漆酶介体体系在降解纸浆中的树脂需要维持在酸性或中性的范围内。由于通常制浆过程在碱性环境中完成[36]。在使用漆酶介体系统进行纸浆树脂的脱除时，必须要考虑到对纸浆pH值的调节，这样才能使漆酶介体系统在最佳pH值下进行树脂的脱除。

5、漆酶在废纸脱墨过程中的应用

废纸脱墨是使废纸可回收以实现造纸工业可持续发展的有效措施之一。相较于传统的化学脱墨法，酶法脱墨具有效率高、能耗低和污染小等特点[37]。据国外研究表明，利用漆酶/介体系统对废纸（如旧报纸）进行脱墨，脱墨浆的白度和可漂性都有明显的提升[38]。漆酶/介体系统进行废纸脱墨主要是利用了介体使漆酶可以氧化降解木素的非酚型结构单元的特性，从而引发剥皮作用使得纤维表面变得光滑，与此同时，通过介体的协助，漆酶能够进一步使油墨的暴露面积增大，最终达到油墨与纤维的分离目的[39]。

根据Sigoillot等人的研究报道，半纤维素酶与漆酶之间可能具有协同脱木素的作用[40]。为了验证并将其真正投入工业应用，我国研究学者徐清华等对上述两种生物酶与漆酶的协同脱木素作用进行了研究，结果表明二者均可与漆酶进行协同脱木素作用[41]。由于工艺条件的探索对于提高脱墨效率有直接的指导意义，因此北京科技大学的汪顺才对于漆酶/介体系统对废纸脱墨适宜的工艺条件进行了深度研究，通过控制不同的变量来探寻最合适的条件[39]。

图3  在控制不同变量变化10%条件下废纸白度提升比较

由图3可得知，改变pH值对废纸的白度提升影响最大。因为pH值对于有酶参与的化学反应是一个重要的影响因素，pH值可提高酶的反应活性，并且漆酶在最佳的pH值下（pH=9.0）可以最大程度地降低纸浆中的木素含量和提高纸浆性能。漆酶用量也同样重要，在反应过程中，由于部分漆酶可能失活，所以当漆酶用量不足时，可能会导致木素脱除不充分，从而使纸张白度提升不明显；该实验表明漆酶的最佳用量为8kg/t纸。适宜的温度也是生物酶反应的重要条件之一，对于废纸脱墨的反应工艺来说，温度过高会使漆酶失活，而温度偏低会使漆酶所催化的反应无法达到最佳的反应速率，从而导致反应不完全。

碎浆浓度、反应时间以及添加剂（锆化合物）用量对于白度的提升并不明显，但如果这三项变量的数值偏离最适宜的范围同样会导致脱墨不充分。通过实验结果得出碎浆浓度需要维持在7.1%左右，反应时间控制在30min左右，而添加剂锆化合物的用量为2kg/t纸。综上所述，在使用漆酶/介体系统进行废纸脱墨的过程中，找出最适宜的pH值、漆酶用量和反应温度能使反应达到最理想的状态，如何将pH值、漆酶用量以及反应温度控制在最适宜的范围内并且选择相符的协同酶，是使其在应用于实际造纸过程前所面临的最大挑战。

6、结论

通过对制浆造纸工艺上漆酶的不同应用进行文献调研，下列问题值得进一步关注：如何培育和分离出更有效生产的菌种；在漂白中，如何提高漆酶介体系统的稳定性、重复利用性，降低其漂白时间和处理温度；在树脂控制环节中对1-HBT型介体的研究中，如何更有效地提高纸张亮度、降低卡伯值以及更简易的制备；在废纸脱墨过程中，pH值、漆酶用量、温度为影响纸浆白度的主要因素，而碎浆浓度、反应时间以及添加剂用量对白度影响较小，即如何将主要因素控制在最佳范围内。综上所述，随着对漆酶的认识和探索不断深入，使用漆酶-介体系统的生物制浆技术将成为传统化学制浆的重要技术补充。未来的制浆造纸工艺很可能将采用取长补短的整合型工艺，即联合传统工艺中的高效和生物工艺中低排的特点，开发出更为节能和环保的绿色生态友好型制浆造纸过程。

参考文献：

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