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屠宰场土壤蛋白分解菌的试验研究

2020-10-14 335 上传者：管理员

摘要：为减少屠宰场废弃蛋白造成的环境污染，同时为利用废弃蛋白制备氨基酸液体肥获取必要的菌株，试验以兰州市牛羊屠宰场污水池的土样为材料，分离筛选高效的蛋白分解菌。试验筛选得到一株目标菌株，经过形态学鉴定、生理生化和分子生物学鉴定后，该菌株为费格森埃希菌Ehrlichbacteriasp.，编号为NwMCC01910027，蛋白酶活力为69.52U/mL.

关键词：
二次污染
分离
氨基酸肥料
菌株
蛋白分解
资源化利用
酶活性
鉴定
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屠宰场产生的废弃物主要是富含蛋白质的动物瘤胃和肠的内容物及部分血水、废弃的皮毛等。如果不加以处理直接排放，废弃物会对环境造成严重污染。对屠宰场废弃物传统的处理方法有填埋法、焚烧法等[1,2]。但是传统的方法不加以处理，对环境造成二次污染。

近年来，一些文献报道了利用废弃蛋白为原料来制备氨基酸液体肥的研究成果。刘娜等[3]以废弃革屑为原料尝试制备微量元素型含氨基酸水溶肥料。张军等[4]将米曲霉、酵母菌、枯草芽孢杆菌混合进行血粉发酵，结果表明，混合发酵法可以将血粉中存在的蛋白质降解成多肽或游离氨基酸。利用屠宰场废弃物制备氨基酸肥料，可以在保护环境的同时实现废弃物的二次利用。

试验以兰州市牛羊屠宰场污水池的土样为试验材料，分离筛选能够高效分解蛋白质的菌株，并对其进行分子生物学鉴定和酶活性测定，初步探索屠宰场废弃物的资源化利用。

1、材料与方法

1.1试验材料

1.1.1样品采集

试验所需材料来自兰州市牛羊屠宰场污水池中的土壤废弃物。

1.1.2培养基

LB培养液：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L,pH值7.5。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、琼脂10g/L,pH值7.2～7.4。

酪蛋白培养基：磷酸二氢钾0.36g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化锌0.014g/L、Na2HPO4·7H2O1.07g/L、氯化钠0.16g/L、氯化钙0.002g/L、硫酸亚铁0.002g/L、酪蛋白4g/L、胰蛋白胨0.05g/L、琼脂20g/L,pH值6.5～7.0。

哥伦比亚血琼脂平板购自广东环凯微生物科技有限公司

1.1.3仪器与设备

YXQ-LS立式压力蒸汽灭菌器购自上海博讯医疗生物仪器股份有限公司，DHG-9146A电热恒温鼓风干燥箱购自上海精宏实验设备有限公司，MOST蒸汽灭菌器购自山东新华医疗器械股份有限公司，AR224CN电子天平购自奥豪斯仪器常州有限公司，Pico17高速离心机购自北京宏达恒业科技有限公司，DYY-6D型电泳仪电源购自广东格兰仕微波生活电器制造有限公司，PCR扩增仪购自德国Biometra公司，No.ChemiDoc蛋白印迹免染检测分析系统购自时代联想生物科技有限公司，CKX53生物倒置显微镜购自奥林巴斯，MJ-25OF-1霉菌培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，FM70雪花制冰机购自北京长流科学仪器有限公司。

1.2试验方法

1.2.1分离纯化

称取2g样品，用无菌水进行梯度稀释，吸取适量悬液涂布基础培养基，37℃培养48h，筛选出生长良好且菌落单一的菌株接种于相应的150mLLB培养基中（37℃），在转速180r/min条件下，恒温摇床扩大培养48h后对该菌株进行富集培养。在基础培养基上稀释涂布法进行菌株的分离纯化。

1.2.2初筛与复筛

以酪蛋白培养基作为初筛培养基，将分离纯化后的菌种在酪蛋白培养基上产生的透明圈对菌种进行初筛，恒温37℃培养48h，分离出能够产生蛋白酶进而分解蛋白质的菌种。将得到的菌种在哥伦比亚血平板上进行菌种复筛，37℃培养24h，按照其透明圈的大小筛选出一株能够高效降解废弃物的菌株。

1.2.3形态学观察

将筛选得到的菌种接种于营养琼脂培养基上，在37℃下培养38h，采用革兰氏染色后，在光学显微镜下观察菌种形状、大小、颜色、边缘、隆起、透明度等。

1.2.4菌株生理生化鉴定

将纯化的菌株接种于LB液体培养液培养24h后，分别将50μL菌液移入麦芽糖、甘露醇、蔗糖、硝酸盐还原、DNA酶、棉籽糖、卫茅醇、硫化氢、枸橼酸盐等生化管中。分别培养至规定时间，记录其结果。

1.2.5菌株分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，作为扩增的模板。采用16SrRNA作为通用引物，上游引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）；下游引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），利用聚合酶链式反应（PCR）扩增菌株的16SrDNA的基因序列，PCR体系和扩增条件见表1和表2。

表1PCR体系

表2PCR扩增条件

变性、退火、延伸过程循环30次。扩增反应完成后，将3μLPCR产物与1μL6×Loadingbuffer充分混合，向1.0%琼脂糖凝胶点样孔中点样，并进行琼脂糖凝胶电泳，电压120V，电泳时间为20min。电泳结束后，将凝胶置于紫外成像仪下，观察各PCR产物的位置，参照DNAMarker确定各产物的分子大小。将电泳结果正确（16SrDNA全长为1500bp左右）的孔对应的PCR样品送华大基因公司进行测序。将测序结果菌株的序列输入到NCBI进行核酸Blast比对，并运用MEGA7.0构建菌株系统发育树[5]。

1.2.6蛋白酶活性的测定

1.2.6.1粗酶液的制备

经两次活化的菌株接种到含有150mL牛肉提取物蛋白胨液体培养基的三角瓶中，37℃、180r/min发酵培养48h。过滤去除菌体，滤液经过离心取上清获得粗酶液。

1.2.6.2蛋白酶活性测定方法

蛋白酶活性测定参照GB/T28715—2012《饲料添加剂酸度和中性蛋白酶活力的测定分光光度法》方法。底物和酶液分别40℃条件下预热2min，取0.5mL稀释至适当倍数的酶溶液，40℃与0.5mL底物精确反应10min，然后立即加入1mL10%三氯乙酸终止反应。40℃条件下继续保温10min后离心，将0.5mL上清液与2.5mL0.4mol/LNa2CO3溶液混合，加入0.5mL福林酚试剂，充分混匀后在40℃下培养20min。对照管终止反应后再加底物。用水代替滤液作为空白调理仪的零点，用分光度计测定样品在660nm波长处的OD值，并用分光度计测定对照管在660nm处的OD值。

1.2.6.3酪氨酸标准曲线的绘制

在不同浓度的1mL酪氨酸溶液中，各加入5mL的0.4mol/LNa2CO3溶液、1mL福林酚试剂，在40℃恒温水浴中显色20min，于680nm波长下测定吸光度，对照使用空白管（酪氨酸为0mg/L），以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

2、结果与分析

2.1菌株形态特征

分离纯化后观察平板划线菌落并对其特点进行记录，形态特征见表3。

表3菌株形态特征

2.2菌株形态学鉴定结果

在兰州市牛羊屠宰场土壤废弃物中分离得到的菌株在血琼脂培养基上生长的情况见图1。

图1菌株生长情况

菌株NwMCC01910027经过革兰氏染色后在光学显微镜下观察到的的菌体形态见图2。

图2革兰氏染色结果

按照《常见细菌系统鉴定手册》[6]进行初步分类，结果表明，NwMcc01910027菌株为革兰氏阴性菌。

2.3菌株的生理生化鉴定结果

纯化后菌株NwMCC01910027的生理生化鉴定结果见表4。由表4可知，分离得到的菌株可以利用枸橼酸盐，能够发酵蔗糖，产生硫化氢，不能够产生DNA酶。

表4生理生化特性鉴定结果

2.4菌株的分子生物学鉴定结果

菌株的分子生物学鉴定结果见图3。

由图3可知，NwMcc01910027的扩增条带大约为1500bp左右。最左边为Marker，条带清晰，无拖尾现象。

菌株系统发育树见图4。由图4可知，NwMcc01910027与Escherichiafergusonii（费格森埃希菌）亲缘关系最近，与其同源性达到99.79%。

图3琼脂糖凝胶电泳图

图4菌株系统发育树

2.5蛋白酶活性的测定结果（见图5和表5)

图5酪氨酸标准曲线

通过酪氨酸标准曲线可以得到，K值为102.04。

表5酶活力测定结果对比

由表5可知，试验获得的NwMcc01910027菌株粗酶液的蛋白酶活力相对较高，为69.52U/mL。因此，确定NwMcc01910027为筛选的目标菌株。但是与赵群丽等[8]获得的菌株的蛋白酶活力相比还是较低，可能是与培养基成分以及培养条件有关，后续将开展NwMcc01910027菌株的血液降解工艺优化试验和酶解产物分析的研究。

3、讨论

本试验为筛选可以降解蛋白质并制备氨基酸液体肥做了基础的研究工作。氨基酸液体肥的应用逐渐广泛，与其他类型的肥料相比，氨基酸液体肥具有显著的发根、促苗、壮秆、抗逆、防裂、增产、优质等作用，且使作物中的可溶糖和可溶性固形物的含量得到提升[9,10,11]。

使用蛋白性废弃物生产氨基酸液体肥，可以提高废弃蛋白附加值，保护环境，实现资源的可持续发展[12]。Ghasemi等[13]通过对氨基酸螯合锌的研究发现，其对生菜的生长有一定的促进作用。储成江[14]对含氨基酸微量元素水溶肥料在水稻大田示范中的应用效果，研究表明可使水稻增产7.56%。Ammar等[15]研究发现，使用氨基酸肥料可以提高小麦幼苗在盐胁迫条件下的抗性。Ghasemi等[16]研究发现，一些氨基酸螯合物可以在某些程度上提高番茄对盐胁迫的抗性。彭智平等[17]通过田间试验研究氨基酸液肥在沙糖桔生产上的应用，发现氨基酸液体肥可以提高某些作物中可溶性糖的含量，有效地提高果实中的糖酸比。杨宜生[18]研究发现，氨基酸液体肥可以提高西瓜果实的品质。在本试验中，菌株产生的蛋白酶的活力为69.52U/mL，相比之下蛋白酶活力较低，分析可能是与培养条件以及培养基成分等有关，后续试验将调整培养条件等进而提高菌株产生的蛋白酶的活力。

利用废弃物生产氨基酸液体肥，不仅保护环境，而且能够对废弃物资源化利用。屠宰场废弃物传统的处理方法会导致环境的污染及资源的浪费。微生物降解法可以很好地解决这一问题，并且还具有成本低的优点。后续试验将对微生物降解血液的工艺试验进行优化，并对菌株的药物敏感性试验做进一步的验证。

4、结论

本试验以兰州市牛羊屠宰场中的土壤为样品，利用稀释涂布法进行分离纯化得到NwMcc01910027菌株。经过形态学鉴定、生理生化鉴定以及分子生物学鉴定，NwMcc01910027菌株为费格森埃希菌Ehrlichbacteriasp.，为革兰氏阴性菌，菌株产生的酶活为69.52U/mL。

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基金:“科技助力经济2020”重点专项“屠宰牛血液废弃物的生物处理与资源化利用(SQ2020YFF0405583)”;西北民族大学2019年国家级大学生创新创业训练计划项目“血红蛋白分解菌的筛选与发酵条件的优化(201910742099)”;中央高校基本科研业务经费“屠宰血液蛋白废弃物的资源化利用(31920200115)”;教育部“创新团队发展计划(IRT_17R88)”