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不同龋深状态下人成牙本质细胞的凋亡及Bcl-2,Bax的表达

2020-10-08 123 上传者：管理员

摘要：目的：探讨龋病进展中人成牙本质细胞的凋亡情况及可能机制。方法：选择即刻拔除的第三磨牙80颗，正常牙、浅龋、中龋和深龋各20颗。HE染色、TUNEL染色和免疫组化染色后观察龋损部位下方成牙本质细胞的凋亡情况及Bcl-2、Bax的表达。结果：①中龋以后，成牙本质细胞数量明显减少，凋亡指数随龋病的进展而逐步升高。②正常牙组和浅龋组Bcl-2及Bax的表达水平均较低，中龋组和深龋组两蛋白表达水平均显著升高，但Bax的升高幅度更显著，Bcl-2/Bax蛋白比值降低。结论：随着龋损的进展，成牙本质细胞凋亡增多，Bcl-2/Bax蛋白比值变化是调控其凋亡的重要机制。

关键词：
Bax
口腔科
成牙本质细胞
细胞凋亡
龋病
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成牙本质细胞位于牙髓最外围，是最早接触外界刺激的细胞，可以更早更敏感的反映牙髓组织的损伤修复反应。本实验通过研究不同龋深标本中成牙本质细胞的凋亡情况及Bcl-2、Bax的表达情况，探讨Bcl-2、Bax在龋病进展中的变化规律。

资料和方法

一、实验主要仪器和试剂

石蜡包埋机、RM2255半自动切片机、303AS-1型数显隔水式培养箱、CX41多功能显微镜、CX40多功能显微镜、Bcl-2及Bax鼠抗人单克隆抗体、超敏型二步法检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒。

二、实验标本

经患者知情同意，选牙根发育完成且可完整拔除，但无治疗与保留价值的第三磨牙，病损均为牙合面慢性龋，正常牙、浅龋、中龋和深龋各20颗。拔出后即刻截根固定，脱钙，石蜡包埋、切片。

三、实验方法

1.HE染色：HE染色，光镜下（400倍）测量100μm成牙本质细胞层长度的成牙本质细胞数目，测定区域选择在髓顶中部下方，如果有修复性牙本质形成，测量其下方的成牙本质细胞数目。

2.TUNEL染色：切片脱蜡至水，胰蛋白酶消化液37℃孵育30min,TUNEL反应混合液37℃孵育1h,converter-POD37℃孵育30min,DAB显色5min，苏木素复染，脱水透明，封片。阴性对照省略TdT。

胞核2/3为棕黄色或褐色的细胞为凋亡细胞。观察部位及计数方法同HE染色。计算凋亡指数：AI=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

3.免疫组化染色：切片脱蜡至水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶活性，Bcl-2或Bax鼠抗人单克隆抗体工作液37℃孵育2h,polymerHelper37℃孵育30min,poly-HRPanti-MouseIgG37℃孵育30min,DAB显色5min，苏木素复染，脱水透明，封片。Bcl-2和Bax均以胞浆内出现棕黄色染色为阳性染色。观察部位同HE染色。采用Moticmedical6.0图像分析系统进行定量分析。

四、统计学分析

使用SPSS13.0进行统计学分析，P<0.05，差异有统计学意义。

结果

一、HE染色

正常牙组（A）和浅龋组（B）：未见修复性牙本质形成，成牙本质细胞体积大、数量多，排列整齐连续，呈高柱状，胞浆丰富，数量约为15.42（正常牙组）和15.71（浅龋组）。

中龋组（C）：大部分中龋龋损部位下方有修复性牙本质形成，厚度不一，其下方的成牙本质细胞数量锐减，约为9.91，呈矮柱状或立方状，胞浆较少。

图1HE染色，×400

图2TUNEL染色，×400

图3Bcl-2免疫组化染色，×400

图4Bax免疫组化染色，×400

深龋组（D）：龋损部位下方均有较厚修复性牙本质形成，其下方的成牙本质细胞减少至6.41，单层排列，细胞呈立方状或扁平状，体积小，胞浆少。

实验结果及统计分析详见附表1。

二、TUNEL染色

实验结果及统计分析见附表2。

三、免疫组织化学染色

表1成牙本质细胞细胞数目及蛋白表达情况

表2凋亡细胞指数

蛋白Bcl-2和Bax在牙髓组织中均呈阳性表达，成牙本质细胞层染色较固有牙髓细胞明显。实验结果及统计分析详见附表1。

讨论

因牙冠有釉质包裹，正常情况下外界的刺激不会引起牙髓反应，所以正常牙无修复性牙本质形成。偶然存在的细胞凋亡是维持牙髓细胞数目稳定的重要方式，这与Mitsiadis[1]等学者的研究结果是一致的。成牙本质细胞数量多，体积大，胞浆丰富，说明细胞状态良好，具有较强的防御修复能力。

浅龋组牙髓与正常牙组无明显区别。推测牙本质尚未暴露，浅龋对成牙本质细胞的影响并不明显。这与方碧松[2]的研究结果是一致的。偶见凋亡细胞，但分布散在，无集中趋势，考虑为细胞的正常生理凋亡。成牙本质细胞状态良好，具有较强的防御修复能力。

中龋组TUNEL染色显示龋损下方成牙本质细胞的凋亡指数升高，与Mitsiadis等学者[3]的研究结果一致。凋亡增多提示此时细菌及内毒素可以经暴露的牙本质小管刺激成牙本质细胞突起，进而引起胞体的凋亡。中龋组成牙本质细胞的数量因凋亡增多而减少，同时体积变小，胞浆变少，使得成牙本质细胞的修复能力下降。所以一旦龋病进展到中龋后，就要对近髓处进行护髓处理，以减少粘接剂及充填材料对牙髓组织的刺激。

深龋组中，修复性牙本质下方的成牙本质细胞呈立方状甚至扁平状，可能是因为大量的刺激物影响了牙髓细胞向成牙本质细胞的分化成熟，使细胞停留于分化的某一阶段；也有可能是因为细胞的数目过少，相互之间缺乏挤压，所以彼此平铺成扁平状。随着龋损的加深，剩余牙本质不断变薄，对外通透性明显增加，使得牙髓组织对外界刺激更加敏感，损伤反应亦更为严重[4]，深龋组的修复性牙本质较中龋组厚且范围广泛。由于细胞大量凋亡，修复性牙本质下方的成牙本质细胞数量很少，而且体积小、胞浆少，修复防御能力很差。此时即使去除外界刺激进行护髓充填治疗，受损的牙髓也较难恢复正常[5]。

Bcl-2是最早发现的抗凋亡基因，可显著延长细胞的寿命，抑制其发生凋亡[6,7];Bax的微观结构形态与Bcl-2极为相似，是Bcl-2活性的主要调控因子。Bax可以与Bcl-2结合成异源二聚体发挥抗凋亡作用，还可以形成同源二聚体诱导细胞凋亡[8]。

本实验结果显示，正常牙组和浅龋组中Bcl-2、Bax的表达水平均较低。提示两蛋白的表达量处于平衡状态或Bcl-2占少许优势，细胞凋亡的易感性差，故少有成牙本质细胞凋亡。

中龋组中Bcl-2、Bax的表达水平均升高，Bax增高幅度较为明显（Bcl-2/Bax为0.841）；深龋组中，两蛋白的表达水平更高，Bax的增高幅度尤为明显（Bcl-2/Bax为0.776）。其机理可能是：在龋损刺激强度较大时，细胞内Bax基因被大量激活，其调控表达的Bax也就明显增多，使得Bcl-2/Bax比值降低；此时，为了平衡Bcl-2和Bax的比例，Bcl-2也被激活，其调控的Bcl-2也相应增加。但即使如此，Bcl-2/Bax比值仍旧呈降低趋势，使得细胞凋亡的易感性增加，出现明显的细胞凋亡，造成成牙本质细胞数目锐减。这与成牙本质细胞计数结果和凋亡指数是一致的。

本研究发现，Bax在龋病进展中变化幅度最明显，Bcl-2/Bax比值是成牙本质细胞应对外界刺激的重要调控因素。

参考文献：

[2]方碧松,李玉晶,葛丽华,等.釉质龋牙髓损伤反应的观察.北京口腔医学,2009,17(5):252-255.

张淳,许丽华.不同龋深状态下人成牙本质细胞的凋亡及Bcl-2,Bax的表达[J].现代口腔医学杂志,2020,34(05):264-266.