大型食用真菌的遗传生理与生长发育一直是研究的热点之一,内容多集中于细胞核遗传对其生长发育的影响。BASSE等发现当细胞质不同或者线粒体发生突变时,真菌子代在种质性状上会呈现出明显的差异[1];HSU等在研究外源添加葡萄糖、氯化钠、氯化铵等对线粒体的影响时,发现携带不同线粒体DNA(mtDNA)基因型的酵母杂交种对环境的适应性存在明显的差异[2]。1988年,HINTZ等根据研究结果推测双孢蘑菇菌丝的生长与细胞质环境中的线粒体基因有密切关系[3]。CHENG等依据香菇双核体子代中的细胞核组成检测结果,发现不同细胞质条件下,香菇(Lentinulaedodes)双核体中核的组成比例存在较大差异[4]。2011年,刘靖宇等首次通过双向核迁移技术获得的两个具有相同细胞核和不同受体细胞质的香菇双核菌株,其结果显示这两个菌株在菌落形态和出菇期方面存在明显差异,这表明香菇的这些性状差异可能与其细胞质中存在的某些生理活性物质有关[5]。SONG等对中国两个香菇种群的线粒体基因组类型的分析结果显示,对于香菇菌株的准确鉴定,应采用细胞核和线粒体分子标记的双重鉴定[6]。2019年,叶丽云等通过构建肺形侧耳(Pleurotuspulmonarius)同核异质菌株,并分析线粒体基因对肺形侧耳菌丝生长的影响,发现肺形侧耳线粒体基因会影响核基因的表达,同时对菌丝生长与营养成分也会产生明显影响[7]。上述研究均表明由于受体细胞不同所导致的不同细胞质环境,将会对菌株生物学性状,尤其是菌丝性状产生明显的影响,但是不同细胞质环境对相同细胞核的作用机理,尤其是对于菌株菌丝生长代谢的调控机理尚未见报道。

金针菇(Flammulinafiliformis)学名毛柄金钱菌,隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、伞菌目(Agaricales)、口蘑科(Tricholomataceae)、金钱菌属(Flammulina)[8]。金针菇是一种典型的异宗结合双因子四极性的大型担子菌,其子实体在颜色上明显可分为白色和黄色。由于其生长温度较低、易于实验室培养的特性,目前金针菇已成为研究大型真菌遗传生理、生长发育机制和环境胁迫的潜在模式生物之一[9,10]。双向凝胶电泳技术是蛋白质组学的核心技术之一,具有操作简单、可重复性好等优点,适用于样本数量相对较少,尤其是两种及两种以上平行样本的差异蛋白质分析。为此,笔者以金针菇的黄色单核菌株Y33和白色单核菌株W8为供试菌株,通过双向核迁移技术获得一对同核异质的双核菌株Y8-33和W8-33,之后,采用双向电泳技术对其菌丝样品进行蛋白质组学分析,以期为揭示不同细胞质对金针菇菌丝生长的影响及其生理调控机制提供参考。

1、材料与方法

1.1供试菌株

单核菌株Y33分离自黄色金针菇(F.filiformis)菌株F0027(三明1号),单核菌株W8分离自日本的白色金针菇菌株F0012,在山西农业大学食用菌实验室构建的金针菇单核群体中Y33交配型为A1B2、W8交配型为A5B6;上述菌株均由山西农业大学食用菌中心提供。

1.2主要试剂与仪器

IPG预制胶条、载体两性电解质购自美国Bio-Rad公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒、过硫酸铵、BBOT荧光增白剂、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、二硫苏糖醇、十二烷基硫酸钠、四甲基乙二胺、苯甲基磺酰氟、乙二胺四乙酸、碘乙酰胺、尿素、硫脲、甘油、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝G-250、蛋白质Marker和牛血清白蛋白均购自北京索莱宝有限公司;其他试剂均为国产分析纯。引物购自上海生工生物工程股份有限公司。

Quintix313-1CN电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)、UV-1800PC紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)、5804R高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、Milli-QAdvantageA10超纯水系统(美国密理博公司)、MICROTERBio6000扫描仪(上海中晶科技有限公司)、RLD-450A人工气候培养箱(宁波乐电仪器有限公司)、HFsafe1200LC生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司),PROTEINi12等电聚焦仪、C1000TouchPCR仪和GelDocTMXR+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)。

图1双向核迁移图

1.3异质双核菌株的获取

参照文献[5]的方法,在生物安全柜内,将菌株W8、Y33活化3代后,分别取直径为8mm的菌丝块接种于含有PDA培养基的培养皿(直径90mm)中(两菌丝块相距约20mm),置于人工气候培养箱(24℃)中避光培养7d,在菌株Y33一侧(图1c)挑取具有锁状联合的双核菌丝,并将该双核菌株与菌株Y33进行双-单杂交,置于24℃条件下避光培养7d,在远离杂交线的菌株Y33的菌落一侧挑取具有锁状联合的菌丝,从而获得具有黄色金针菇单核菌株Y33细胞质的双核菌株Y8-33。同样方法获得具有白色金针菇单核菌株W8细胞质的双核菌株W8-33。

1.4单核菌株和异质双核菌株的菌落形态观察与镜检

将单核菌株W8、Y33和新获得的一对同核异质的双核菌株W8-33、Y8-33同时分别接种于PDA培养基(直径90mm)中央,在24℃条件下暗培养7d,观察各个菌株的菌落形态与菌丝生长情况,每个菌株设置5个重复;之后,采用荧光增白剂BBOT分别对4个菌株的菌丝进行染色处理,并置于荧光显微镜下进行观察。

1.5异质双核菌株的分子验证

参照文献[11]的方法分别提取4个金针菇菌株菌丝体的DNA。基于笔者在金针菇的种质资源的遗传分析所取得结果(未发表),选取19个简单重复序列间扩增通用引物(表1)对所获取的双核菌株及其对应的单核菌株进行多态性分析。

ISSR分析反应体系为25μL,其中包括90ng·μL-1模板DNA1μL,10×buffer2.5μL,dNTP2μL,1.5UrTaq聚合酶0.5μL和0.6μmol·L-1引物1μL,双重蒸馏水补齐剩余体积。扩增反应程序:95℃预变性3min;94℃变性30s,50℃退火60s,72℃延伸1min,35个循环;72℃延伸10min,扩增产物于4℃保存。

表1ISSR引物序列

1.6菌丝液体培养与收集

分别取4个活化后的W8-33、Y8-33菌丝块(直径8mm,距离菌落边缘约2cm的区域),转接于含有100mLPDB培养基的三角瓶(250mL)中,置于黑暗条件下摇床培养(24℃、120r·min-1),振荡培养3d。之后,静置培养15d,收集菌丝样品,保存于-80℃冰箱中备用。

1.7蛋白质的提取

参照文献[12]的方法,略作改动。在研钵中加入液氮分别将W8-33和Y8-33的菌丝体研磨成粉末。每100mg菌丝体粉末加入0.3mL蛋白质抽提液(pH7.8,含500mmol·L-1Tris-HCl、50mmol·L-1EDTA、2%β-巯基乙醇、2mmol·L-1PMSF),-20℃放置10min,加入相同体积的Tris-饱和酚。在4℃、13000g条件下离心20min,倒掉上层,取出下层的有机相。加入4倍体积预冷的甲醇,-20℃放置6h以上或者过夜。在4℃、13000g的条件下离心20min,去上清,留沉淀。用预冷甲醇洗涤吹洗蛋白质沉淀,再以相同的条件离心20min,去上清,将沉淀置于超净台内吹干。加适量蛋白质溶解液(7mol·L-1尿素、2mol·L-1硫脲、2%CHAPS、65mmol·L-1DTT、0.4%载体两性电解质、0.001%溴酚蓝)充分溶解,在4℃、14000g条件下离心20min,备用。

1.8蛋白质浓度的测定

以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白制作标准曲线,按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒的方法测定蛋白质含量。

1.9蛋白质组双向电泳图谱分析

按照蛋白质双向电泳实验操作手册进行,对部分实验参数进行优化,设置生物学重复3次。选用规格为pH4～7、17cm的IPG预制胶条,上样量为3mg,上样总体积为400μL,进行第一向等电聚焦(IEF)电泳,之后,将聚焦结束的胶条立即进行平衡,并进行第二向SDS-PAGE电泳。

将完成双向电泳的凝胶在固定液(250mL无水乙醇、50mL冰乙酸、200mL超纯水)中固定0.5h,采用考马斯亮蓝G-250染液染色,慢摇(40r·min-1)过夜,用超纯水脱色,之后使用扫描仪对脱色后的凝胶进行扫描,用BioRadPDQuest8.01软件进行分析。

1.10基质辅助激光解吸电离质谱分析与数据库检索

将筛选出的差异蛋白点用塑料刀片切下,委托上海拜谱生物科技有限公司进行基质辅助激光解吸电离。

2、单核菌株和异质双核菌株的菌落形态观察与显微镜镜检结果

菌落形态观察结果(图2上):单核菌株W8和Y33在气生菌丝的浓密度与菌落边缘的整齐度方面呈现明显差异;与出发单核菌株W8和Y33相比,获得的一对具有相同细胞核的异质双核菌株W8-33与Y8-33的菌丝生长速度明显加快,且菌落内菌丝密度较高,气生菌丝浓密;与菌株W8-33相比,菌株Y8-33的菌丝生长较为浓密,气生菌丝较多,而菌株W8-33的菌丝多呈匍匐型。

四个菌株经过荧光增白剂染色镜检结果(图2下):在菌株W8、Y33的菌丝中均未发现锁状联合结构;在菌株W8-33、Y8-33的菌丝均可观察到清晰、典型的锁状联合结构,据此确定通过双向核迁移技术获得的2个菌株均为典型的双核菌株。

图2金针菇供试菌株菌落形态(上)和显微镜观察结果(下)

异质双核菌株的ISSR鉴定结果显示:有5个ISSR通用引物(ISSR1、ISSR6、ISSR17、ISSR19、ISSR22)的PCR扩增产物在菌株Y33、W8之间呈现明显的差异,其凝胶电泳结果表明通过双向核迁移技术获得的一对双核菌株的2个核分别来自于所采用的2个单核菌株(图3);(2)通过双向核迁移技术获得的异质双核菌株Y8-33、W8-33具有很高的相似性,所选ISSR引物的PCR扩增产物的多态性并不能将两者区分开。

2.1金针菇异质双核菌株的菌丝蛋白质双向电泳图谱分析结果

将采用1.6中方法提取的金针菇双核菌株W8-33、Y8-33的菌丝蛋白质样品经双向电泳图谱分析后发现,以菌株W8-33为对照组,通过PDQuest软件分析检测出约160个蛋白点,这些蛋白主要集中在等电点5～6.5,相对分子质量为20～66,蛋白表达丰度出现差异的蛋白点有49个,上调表达的蛋白有34个,下调表达的蛋白有15个(图4)。

图3ISSR引物PCR扩增图谱

图4金针菇菌株W8-33和Y8-33菌丝蛋白的二维电泳图谱

2.2差异蛋白的鉴定与分类

选取的17个差异表达量在2倍以上的蛋白胶点经酶解、测序与检索,共鉴定出17个蛋白,包括8个上调蛋白和9个下调蛋白(表2),识别率为89.5%。功能注释结果显示,鉴定出的17个蛋白与能量代谢、次生代谢、信号转导、细胞骨架结构和调控功能有关。

在已鉴定的蛋白质中,以W8-33菌丝样品为参照,与能量代谢相关的蛋白,如果糖二磷酸醛缩酶,与次生代谢相关的蛋白,如谷胱甘肽-S-转移酶,与信号转导相关的蛋白,如ARF/SAR超家族、热激蛋白70(heatshockcognate70)和热激蛋白HSS1在Y8-33中上调;而与Y8-33菌丝样品相比,与细胞骨架结构相关的微管蛋白、与调控相关的14-3-3蛋白(14-3-3protein)和热激蛋白90(HSP90-domain-containingprotein)在W8-33中菌丝样品中均上调表达。

图5金针菇菌株W8-33(A)与Y8-33(B)的菌丝差异蛋白局部放大图

表2与菌株W8-33相比的金针菇菌株Y8-33菌丝中差异蛋白的鉴定

3、讨论

笔者采用双向核迁移技术获得一对同核异细胞质的金针菇双核菌株W8-33和Y8-33,两者的菌落形态和菌丝生长速度均存在明显差异,该结果与刘靖宇[5]和叶丽云[7]的研究结果相一致。

采用双向电泳技术对W8-33、Y8-33的菌丝样品进行蛋白质组学分析,鉴定出的差异表达量在2倍及2倍以上的差异蛋白有17个。与菌株Y8-33的菌丝样品相比,14-3-3蛋白、热激蛋白90结构域蛋白以及4个微管蛋白在受体为W8-33的菌丝样品中均呈现明显上调表达。14-3-3蛋白是真核生物中高度保守的、普遍存在的表达蛋白质,该蛋白质可以和许多信号蛋白,如激酶、磷酸酶和跨膜受体等结合,对细胞的信号转导、细胞周期和应激反应等关键过程的调控起重要作用[13]。在生物体中,14-3-3蛋白可以通过促进细胞分裂激酶-1(BMK1)来调控细胞的生长[14]。有研究表明在白腐真菌中,14-3-3蛋白可能参与真菌菌丝的蛋白质分泌过程,进而对其生长生理发挥相应的调控作用[15,16]。在不同细胞质环境下14-3-3蛋白表达量增加,表明该蛋白可能参与细胞质环境对菌丝生长的功能调控,但具体参与过程还需进一步的研究。热激蛋白90一般作为分子伴侣参与生理活动,在信号转导、蛋白质折叠与降解和应激反应调节方面起到重要作用[17]。微管蛋白是生物细胞骨架的主要组分之一,在真菌菌丝生长过程中,由微管蛋白和肌动蛋白相互依赖的协同作用,分泌囊泡从菌丝体向顶端的连续流动以建立和维持极性的关键步骤,也是细胞壁和细胞膜伸展、细胞膜重塑以及细胞质分裂的必要条件[10,18]。同时,该协同作用也可能在大型真菌信号转导与组织形态发生改变中发挥至关重要的作用[19]。笔者发现:在实际生产中,与白色金针菇品种相比,现有黄色金针菇品种普遍具有现蕾时间较早与抗逆性较强的生物学特性,这一研究结果将为金针菇不同颜色品种间生理差异机制的深入研究提供参考。

笔者还发现,与菌株W8-33的菌丝相比,在受体为白色菌株细胞质的双核菌株Y8-33菌丝中,ARF/SAR蛋白家族、果糖二磷酸醛缩酶、谷胱甘肽-S-转移酶以及热激蛋白HSP70与HSS1均呈现上调表达。ARF/SAR蛋白家族属于小G蛋白家族,主要通过调控囊泡运输的方式参与细胞的物质交换和信息交流[20],是维持机体正常运行的一类重要的信号转导蛋白。果糖二磷酸醛缩酶不仅在糖酵解途径中是关键酶,而且在卡尔文循环中和磷酸戊糖途径中也是重要限速酶之一,主要参与果糖二磷酸的合成与分解,进而参与能量的形成与分解[21]。谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)在菌丝体内广泛存在,该酶通过促进谷胱甘肽(GSH)与活性氧、羟基自由基等有害代谢产物的结合,进而提高菌丝对生物与非生物胁迫环境的适应能力[22]。热激蛋白HSP70与HSS1是目前研究最多的应激蛋白之一。研究表明:热激蛋白HSS1对于双孢蘑菇(Agaricusbisporus)菌丝在受热胁迫条件下维持自身稳定发挥重要作用[23]。在真菌体内,热激蛋白HSP70主要作为分子伴侣参与生命活动,在外界胁迫刺激时被激活,从而提高细胞耐受性[24]。当菌丝内的蛋白质折叠发生错误时,HSP70大量表达以矫正蛋白质的结构,帮助其功能恢复正常[25]。笔者之前的研究也表明在低温与光照的胁迫条件下,果糖二磷酸醛缩酶、谷胱甘肽-S-转移酶与在金针菇菌丝内的表达量呈现明显上升[26]。本实验中,在24℃黑暗培养7d后,与其具有相同细胞核的但受体为白色菌株细胞质的双核菌株W8-33的菌丝多为匍匐型相比,受体为黄色菌株细胞质的双核菌株Y8-33菌丝生长较为浓密,气生菌丝较多。这一研究结果可能为现有白色金针菇品种可产生原基量较大,并具有较强耐寒性的分子调控机制的揭示提供参考。

通过双向核迁移技术获得一对金针菇同核异质的双核菌株,结果显示不同细胞质环境会对金针菇菌丝的长速、长势等生物学性状产生明显的影响。利用双向电泳技术对其进行分析后发现,不同细胞质环境对金针菇细胞核的基因表达可能起到重要的调控作用。这一研究将为不同颜色金针菇品种间生物学特性差异分子调控机理的揭示提供参考,同时也为金针菇乃至其他食用菌的品种选育、种性改良方面等提供新的思路。

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宋淋浩,卫银,武晨剑,常明昌,孟俊龙,刘靖宇.不同细胞质的金针菇菌丝差异蛋白分析[J].食用菌学报,2020,27(02):8-16.

基金:山西省自然科学基金面上项目(201801D121240);山西省煤基重点科技攻关项目(FT2014-03-01);山西省重点研发计划重点项目(201603D21106).