首页 > 论文范文 > 农业科技论文 > 农艺学论文 > 农作物论文 > 无芒雀麦种质资源遗传多样性在ISSR标记的表现分析

无芒雀麦种质资源遗传多样性在ISSR标记的表现分析

2020-06-18 246 上传者：管理员

摘要：本研究以29份来自国内外无芒雀麦种质材料为研究对象，利用ISSR分子标记进行遗传多样性研究，以期为无芒雀麦种质资源的收集、利用和育种提供了理论依据。试验筛选出16对引物进行PCR扩增，共扩增出273个ISSR条带，其中，多态性条带253个，多态性位点百分率达92.67%,Nei’s基因多样性指数(H)的范围在0.255～0.355之间，平均值为0.310。遗传相似系数范围在0.518～0.902之间，平均值为0.649，说明不同无芒雀麦间存在较大差异。在阈值为0.644处，29份材料被分为4类，UPGMA聚类结果显示，各供试材料间的聚类与其地理来源有一定的相关性，主成分分析与聚类结果一致。ISSR分子标记是遗传多样性研究的有效手段。

关键词：
ISSR分子标记
品种选育
无芒雀麦
生物多样性
禾本科
遗传多样性
加入收藏

遗传多样性(Genetic diversity)是生物多样性的重要组成部分，是生物所携带遗传信息的总和，是植物生存、进化、发展的基础，也是植物改良、品种选育的先决条件(谢元元,2013)。遗传变异水平、遗传结构是遗传多样性的重要体现方式(张村等,2005;Munoz et al.,2010)。分子标记(Molecular marker)能够在DNA水平上直接反映生物个体之间的差异。ISSR分子标记综合了RAPD、SSR的优点，具有操作简单、试验成本不高、DNA模板用量少、多态性产物丰富等优点(胡豆豆等,2012)，因此被广泛应用于植物遗传多样性研究(李洋溢等,2016)、亲缘关系(Guo et al.,2014)、种质资源鉴定(程琴等,2018)等方面。

无芒雀麦(Bromus inermis L.)又称无芒草，禾本科(Gramineae)雀麦属(Bromus L.)的一种多年生优质牧草，其适口性强，牛羊喜食，鲜草产量高，在青饲及储备干草方面作用突出。此外，无芒雀麦适应性强，常用于植被恢复及建立人工草场。目前，ISSR分子标记技术在水稻(陈兆贵等,2009)、玉米等经济作物以及苏丹草(周亚星等,2009)、苜蓿等牧草上广泛使用，有关ISSR应用于无芒雀麦种质资源的研究报道不多。对无芒雀麦ISSR标记的直接研究较早的有宋旭红等(2010)利用对中国内蒙地区及其他地区来源的无芒雀麦进行遗传多样性分析。随后，张雪(2014)对20份无芒雀麦材料进行表型、生理特性研究，并利用ISSR对遗传多样性研究。前人研究中，涉及的新疆无芒雀麦种质材料较少，新疆无芒雀麦种质资源丰富，本课题组前期研究成果也表明供试无芒雀麦表型性状多样性丰富，是进一步开展引种育种工作的理想材料。因此，本研究以11份新疆无芒雀麦、18份国外引进无芒雀麦为材料，筛选出16对ISSR引物用以研究无芒雀麦的ISSR位点多态性，为进一步开展无芒雀麦引种、育种工作提供理论基础。

1、结果与分析

1.1 ISSR多态性分析

随机选择5份无芒雀麦材料(编号17,19,21,23,27)，运用26对引物(表1)进行PCR扩增，约62%(16对)的引物条带清晰且重复性好，其他的引物不能扩出条带或扩增出的条带不清晰(图1)。

由16对ISSR引物对29份无芒雀麦材料的扩增结果(表2)可知，16对引物共扩增出273个ISSR条带，每对引物所扩增出的条带变异范围为10(YW25)到22(YW10)条不等，平均每对引物扩增出17.06个条带，总多态性位点数253个，平均多态性位点数15.81。

数据显示多态性位点百分率达92.67%，说明这些ISSR标记在无芒雀麦基因组中能够揭示较多的信息。用PopGene计算的有效等位基因数的范围为1.384～1.635，平均为1.524,Nei氏遗传多样性指数的范围在0.255(YW8)～0.355(YW4)之间，平均为0.310。Shannon信息指数(I)的范围在0.373(YW26)～0.529(YW4)之间，平均为0.466。说明中国无芒雀麦种质资源间ISSR多态性差异明显。

1.2聚类分析

遗传相似系数(GS)是聚类分析的基础(表2)。29份无芒雀麦种质材料的遗传相似系数范围在0.518～0.902之间，平均值为0.649，其中亲缘关系最近的是来自新疆哈密的2和来自新疆巴里坤的4(GS=0.902)，研究还发现来自加拿大的12和来自俄罗斯莫斯科的14亲缘关系也很近，其遗传相似系数为0.885。遗传相似系数越大，遗传距离就越近。反之，相似系数小则表明遗传距离远。29份无芒雀麦种质材料的遗传相似系数平均值为0.649，说明29份种质之间的亲缘关系相对较远。

表1 ISSR标记的遗传多样性

图1 ISSR引物YW1(A),YW25(B)在29份无芒雀麦材料中的扩增情况

运用Ntsys软件基于相似性矩阵采用UPGMA法对ISSR标记的扩增结果进行聚类分析，绘制出亲缘关系聚类图(图2)。聚类结果表明，在遗传相似系数为0.644处，29份材料被分为4类：第1类有11份材料，包括10份亲缘关系较近的新疆种质及1份亲缘关系较远外来种质；第2类有11份材料，包括1份新疆种质和10份外来种质，亲缘关系十分复杂；第3类有6份材料，均为外来种质；第4类只有1份材料。

1.3主成分分析

主成分分析(PCA)可以直观地反映材料的亲缘关系，种质间位置近表示相似性高，距离远表示差异大。根据29份无芒雀麦材料的“1、0”数据矩阵，基于遗传相似系数，进行主成分分析。将29份无芒雀麦材料视为一个混合的群体，进行二维聚类分析(图3)。二维散点分布图划分的4个区与聚类分析划分的4份区完全一致。第Ⅰ类对应的材料位于二维主成分散点图的A区，新疆大部分材料集中在一类，第Ⅱ类对应散点图的B区，第Ⅲ类对应散点图的C区，第Ⅳ类对应散点图的D区，只有一份材料。因此，说明聚类分析与主成分分析的结果一致。

2、讨论

遗传多样性是生物种群遗传变异和维持变异的重要反馈。本研究利用16对ISSR引物对无芒雀麦进行多态性分析，研究结果表明共扩增出273条带，其中253条为多态性条带，多态位点百分率为92.40%，平均每个引物扩增15.81条多态性条带，表明供试无芒雀麦种质资源具有丰富的多态性。张凤霞(2011)利用9个引物对无芒雀麦进行RAPD扩增，共扩增出87条带，平均每个引物9.67条，多态性条带45条，多态性条带百分率87.36%，平均每个引物扩增条带数、多态性条带百分率均低于本试验所得(17.57,92.40%)，说明ISSR分子标记是无芒雀麦种质资源遗传多样性研究的有效手段。

遗传相似性系数反映群体间的亲缘关系，遗传距离常用来表示样本间遗传分化的程度(田华,2008)。本实验中来自新疆哈密的2和来自新疆巴里坤的4，遗传相似系数最大(GS=0.902)，说明这两份材料亲缘关系较近，可利用回交选育新品种(陈豫静,2019)。来自俄罗斯莫斯科的15与来自新疆哈密的2、新疆巴里坤的4、加拿大的12、俄罗斯莫斯科的14遗传相似度低，说明材料15与其他材料遗传背景相差较远，具有很大的遗传变异，育种潜力巨大。29份无芒雀麦种质材料的遗传相似系数范围在0.518～0.902之间，平均值为0.649，遗传相似系数较低。说明材料间差异较大，遗传多样性丰富，含有丰富的可用于品种选育及改良的潜在基因，遗传相似系数平均值低于侯凯等(2008)、赵光磊等(2010)的研究。主要是因为他人研究中选择的主要材料均为当地的材料或品种，遗传背景相对单一，而本研究采用的是来自中国新疆及国外不同国家的材料，种质来源相对丰富。

表22 9份无芒雀麦材料的遗传相似性分析

图2基于ISSR分子标记的无芒雀麦材料聚类

图3 29份材料的二维主成分分析

利用聚类分析可以明确材料间的遗传多样性及变化趋势，有助于合理选择亲本，充分利用种质资源。聚类分析将29份材料分为4类：第Ⅰ类包括10份新疆种质及1份俄罗斯种质，第Ⅱ类包括5份俄罗斯种质及新疆、乌克兰、吉尔吉斯斯坦、葡萄牙加拿大、美国种质各一份，第Ⅲ类包括2份加拿大种质及4份俄罗斯种质，第Ⅳ类只有1份材料，来自俄罗斯。聚类结果显示，聚类结果与地理距离有一定的相关性，整体相对而言，来自同一地区的材料聚在一起。但聚在一起的并非都来自同一地区，而是趋于多元化，成相互渗透趋势，可能是环境或人为因素使不同地区的无芒雀麦种质间存在一定的基因流。

新疆因其独特的地理位置、气候条件成为世界上无芒雀麦种质资源最为丰富的地区之一。在今后的研究当中，应进一步收集新疆无芒雀麦野生种质资源，完善资源圃，为今后的研究提供基础材料。本研究引进的外来种质对丰富中国无芒雀麦种质资源、进一步开展品种选育工作具有一定的作用，应更深入地、系统地开展综合评价，结合全基因组测序等技术，全面地揭示无芒雀麦种质资源的整体面貌，为充分发挥无芒雀麦种质资源优势，更好地开发利用和新品种选育提供指导。

3、材料与方法

3.1试验材料

29份无芒雀麦供试材料中(表3),11份为采自新疆的野生种质材料(编号1～11)，由新疆农业大学草业与环境科学学院提供，18份为国外种质(编号12～29)，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供(其中，加拿大3份，乌克兰1份，俄罗斯11份，美国1份，吉尔吉斯斯坦1份，葡萄牙1份)。

3.2 DNA提取及检测

采集29份无芒雀麦新鲜叶片，经液氮处理后置于-80℃冰箱保存备用。提取DNA时，加液氮迅速将植物叶片研磨成粉末，采用改良的CTAB法(王芳等,2016)提取植物基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶、核酸检测仪检测提取DNA的质量和浓度。检测到的条带整齐明亮无拖尾，且点样孔中基本没有荧光，说明DNA质量高，将其浓度稀释到20 ng/μL，分管装好，放置于-20℃保存备用。

3.3引物合成及多态性筛选

本研究参照已确定的无芒雀麦ISSR引物序列(宋旭红等,2010;张雪,2014)进行，引物由生工生物技术服务有限公司合成。随机选取5份无芒雀麦(编号17,19,21,23,27)为材料，对初步设计的26对引物(表4)进行筛选，最终筛选出16对条带清晰、稳定性好的引物，用于后续PCR扩增反应。

表3无芒雀麦种质材料来源

表4引物信息

3.4 PCR扩增及产物检测

ISSR反应体系参照张雪(2014)的研究，反应程序在其研究上进行优化。具体如下20μLPCR反应体系。其中，20 ng/μL模板DNA 2.5μL、10×Buffer 2μL、2.5 U/μL Taq酶0.5μL、10 mmol/L dNTP 0.4μL、10 mmol/L的Mg2+1.2μL、25 mmol/L引物0.4μL，剩余体积用双蒸水补充。反应程序：95℃预变性5 min,94℃变性1 min、适宜温度下退火1 min、72℃延伸1 min,40个循环结束后，72℃延伸10 min。扩增反应在PCR仪(德国Eppendorf)上进行。利用聚丙烯酰氨凝胶电泳，对扩增产物进行检测，初步筛选出获得清晰条带、反应稳定的引物。

3.5数据分析

对多态性条带进行统计，在电泳图上清晰且无拖尾的条带，有条带的记为“1”，无条带或条带不易分辨记为“0”。根据统计的10矩阵，运用PopGene计算多态性位点数、多态性位点的百分率、有效等位基因数、Nei遗传多样性指数、Shannon信息指数。运用NTSYS软件计算供试材料的遗传相似系数矩阵，基于UPGMA法聚类分析，并进行主成分分析。

参考文献：

[1]陈豫静,2019,基于SSR、SR-AP标记的榛属种质资源遗传多样性及亲缘关系分析,硕士学位论文,沈阳农业大学,导师:赵玉辉,pp.41.

[2]陈兆贵,郑汉超,赵淑平,2009,47份水稻品种资源的ISSR遗传多样性分析,基因组学与应用生物学,28(3):498-502.

[3]程琴,庞新华,吕平,周全光,谭秦亮,金刚,朱鹏锦,欧克纬,2018,两个桂热甘蔗品种(系)的简单重复序列间(ISSR)分子鉴别,科学技术与工程,18(8):191-195.

[4]侯凯,吴卫,郑有良,杨玉霞,廖凯,黎开强,翟娟园,2008,川产白芷遗传多样性的ISSR分析,四川农业大学学报,26(3):237-240.

[5]胡豆豆,熊小文,欧阳克蕙,2012,分子标记技术在牧草遗传多样性上的研究进展,河南农业科学,41(11):9-13.

[6]李洋溢,雷映霞,高刚,张艳,邓家彬,童珊珊,杨瑞武,2016,基于ISSR分子标记分析国产姜黄属植物的遗传多样性,分子植物育种,14(5):1189-1194)

[7]宋旭红,于涛,田青松,韩冰,2010,69份无芒雀麦种质资源遗传多样性分析,西北农业学报,19(12):87-93.

[8]田华,2008,鲢鳙长江野生群体和养殖体群体微卫星的遗传分化,硕士学位论文,华中农业大学,导师:邹桂伟,pp.26.

[9]王芳,高秋,王杰,马金星,孙娟,2016,利用SSR标记分析高粱属种质资源的遗传多样性,草业学报,25(5):125-133.

[10]谢元元,2013,127份海岛棉遗传多样性分析,硕士学位论文,新疆农业大学,导师:曲延英,pp.4.

[11]张村,李丽,耿立冬,刘元艳,肖永庆,2005,川芎药材有效成分鉴别及其含量标准研究,北京医药大学学报,28(2):66-69.