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关键酶在颠茄生物碱代谢过程中的研究分析

2020-09-01 531 上传者：管理员

摘要：颠茄是一种茄科颠茄属多年生草本植物，全草可入药，是民间传统的药用植物，全株富含托品烷类生物碱，临床主要用于治疗麻痹症、晕动症、胃肠痉挛性绞痛和三叉神经痛等症。但颠茄自然繁殖受限因素多，现存野生种群较少，且野生颠茄中托品烷类生物碱含量很低。本文主要介绍了在颠茄托品烷类生物碱合成途径中关键研究概况，以期为后人利用基因工程技术获取高产托品烷类生物碱提供参考，解决托品烷类生物碱含量低的问题。

关键词：
农作物
基因工程
托品烷类生物碱
氮甲基腐氨转移酶
颠茄
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颠茄的俗名叫野山茄或者颠茄草，是一种茄科颠茄属多年生草本植物。全株高1～2m，根为直径1cm左右的圆柱形，表面有浅灰纵向皱纹。颠茄全植株均可作为药用成分入药，主要部分叶和根含有托品烷类生物碱莨菪碱及东莨菪碱，可制成配剂和浸膏入药，但是其在整个植株中的分布并不均匀，野生颠茄植株中托品烷类生物碱含量较低。大量研究表明[1,2]，颠茄的根和茎中，除了含有托品烷类生物碱，也含有少量的红古豆碱、阿托胺、颠茄宁等有效成分。

在颠茄的次生代谢产物托品烷类生物碱中，最主要的是东莨菪碱与莨菪碱。在临床治疗中，相比与莨菪碱，东莨菪碱对机体的副作用要更小，且药理作用更强。其抑制中枢神经的同时可以阻滞副交感神经，所以在临床上主要用于麻醉、戒毒脱瘾、镇痛、帕金森症及抗晕动症等，市场对其的需求量非常大。但在颠茄中，东莨菪碱的含量要比莨菪碱的含量低很多，而在市场上，东莨菪碱的药用价值要比莨菪碱的价值高很多，这就导致了在临床上东莨菪碱的价值高很多。因此，提高颠茄中东莨菪碱的含量，使其充分发挥经济价值，是亟需解决的问题。

1、颠茄次生代谢产物的研究概况

植物通过次生代谢途径产生的物质称为次生代谢产物。在长期进化的过程中，初生代谢产物（蛋白质、糖类等）与外界的生物或非生物通过不同代谢途径相互作用而产生的物质。在外界特定的条件下，一些重要的初级代谢产物（丙二酸单酰辅酶A、乙酰辅酶A、莽草酸或者一些氨基酸）作为次生代谢合成的原料，又或者再次经历不同的代谢过程，产生一些像黄酮、萜类、生物碱等化合物，我们把这种化合物成为天然产物，又因为这些天然产物是通过次生代谢途径产生的，所以又称为次生代谢产物。一般次生代谢产物在植物生长及发育的过程中并没有关键的作用，但是近年来有研究不断发现，在生长旺盛的细胞中，大多数都有次生代谢途径产生次生代谢产物的合成，而对这些次生代谢产物的研究发现，这些物质对人体有着很强的活性，使其具有特殊的医用价值。

2、颠茄次生代谢产物合成的主要途径

颠茄的次级代谢产物托品烷类生物碱的合成主要以初级代谢产物鸟氨酸及精氨酸作为合成底物。（1）鸟氨酸与精氨酸分别在其脱羧酶的作用下生成腐胺与N-氨基甲酰腐胺，N-氨基甲酰腐胺在其水解酶的作用下生成腐胺。腐胺在N-甲基-腐胺转移酶（PMT）的作用下甲基化，生成N-甲基-腐胺，PMT将腐胺转向多胺，进入到托品烷类生物碱合成的途径。因此PMT是托品烷类生物碱合成过程中的第一个关键酶。（2）由腐胺催化生成的N-甲基-腐胺在二胺氧化酶的催化作用下脱氨生成4-氨基-正丁醛，该物质能自发环化生成1-甲基-Δ-吡咯啉阳离子的阳离子，其可与初级代谢产物丙酮酸缩合形成古豆碱，也可以与烟酸缩合生成尼古丁。在合成托品烷类生物碱的过程中，1-甲基-Δ-吡咯啉阳离子经过一系列反应生成托品酮。（3）两种不同的托品酮还原酶（TRs）将托品酮催化，使托品烷类生物碱的代谢分流：托品酮还原酶Ⅱ（TRⅡ）将托品酮催化生成假托品碱，进一步生成打碗花精A3；另一条途径是托品酮还原酶Ⅰ（TRⅠ），催化托品酮生成托品醇，其与苯乳酸发生酯化反应生成海螺碱（莨菪碱的前体）。（4）细胞色素P-450氧化酶使海螺碱分子重排，从而形成莨菪碱。综合以上反应，TRⅠ是莨菪碱合成的另一个关键酶。（5）莨菪碱在莨菪碱6β-羟化酶（H6H）的作用下羟基化生成山莨菪碱，山莨菪碱紧接着环化，最终生成另一种托品烷类生物碱东莨菪碱。因此，H6H催化的反应也是东莨菪碱合成的最后一个限速步骤，而H6H也成为托品烷类生物碱合成的最后一个关键酶。

3、颠茄次生代谢工程中重要基因的研究概况

托品烷类生物碱合成的分子生物学研究，已在过去几十年中取得了巨大成果，颠茄、莨菪、曼陀罗及三分三等茄科植物中均存在着托品烷类生物碱的生物合成途径。要开展代谢工程的研究，主要将这条代谢途径中重要功能基因进行克隆并鉴定其功能。已有不少研究利用PMT、TRs和H6H等基因遗传改造不同产托品烷类生物碱药用植物，并取得了显著的研究成果[3]。H6H基因被Kanegae等[4]研究者从莨菪的cDNA文库中克隆到，同时发现其在柱鞘中特异性富集。有研究人员将H6H在曼陀罗中过量表达，与对照相比，东莨菪碱的含量提高了3倍多。

Jouhikaninen等[5]研究者将HnH6H基因导入莨菪中，诱发出莨菪的转基因毛状根，并测定其中东莨菪碱的含量，发现与对照相比，其东莨菪碱的含量提高了100倍。将H6H基因过量表达在印度颠茄毛状根中，发现毛状根中东莨菪碱的含量最高达到了5.6mg/gFW，是对照的9倍，测定转基因毛状根中H6H基因的表达量发现，基因表达量越高，东莨菪碱的含量也越高。Hibi等[6]研究人员在研究曼陀罗的根时，克隆了PMT基因，同时证明了托品烷类生物碱合成途径中PMT酶是第一个关键酶。Sato等[7]研究发现，PMT基因的高效表达不但能保证植物的正常生长，还会阻止转基因植物的异常生长，这些对于转基因植物中托品烷类生物碱的积累有很好的促进作用。

对颠茄进行多基因转化的研究中发现，将托品烷类生物碱代谢途径中的3个关键酶基因（PMT、TRI、H6H）双双转入颠茄中，PMT、TRI两个基因的组合使颠茄转基因毛状根中托品烷类生物碱的总含量较空白毛状根提高2.5倍，其中东莨菪碱含量达到了空白毛状根中的5倍多，而莨菪碱的含量比空白毛状根中提高了2倍。在PMT、H6H两种基因的组合中，与空白毛状根相比，转PMT-H6H双基因毛状根中托品烷类生物碱的含量提高到2.7倍，其中东莨菪碱与莨菪碱的含量较空白毛状根相比，分别提高了8.2倍与1.8倍。TRI、H6H两种基因的组合中，与空白毛状根相比，托品烷类生物碱的含量提高至2.6倍，其中东莨菪碱与莨菪碱的含量较空白毛状根相比分别提高了5.6倍与2.1倍。综上研究发现，东莨菪碱和莨菪碱的含量均因PMT、TRI、H6H三种基因的超量表达而有所提高。

4、pmt的研究概况

在托品烷类生物碱代谢的途径中，PMT是一种甲硫氨酸依赖性的甲基转移酶，其可以将腐胺甲基化生成S-腺苷高半胱氨酸和氮-甲基-1,4-丁二胺。研究者[8]相继已经从曼陀罗、三分三、颠茄、莨菪及烟草中克隆出PMT基因。PMT在茄科植物中是由基因家族中的两种基因（PMT1和PMT2）编辑的，PMT1、PMT2两个基因的表达在时空特异性及编码区序列上均具有一定差异。在颠茄的基因组中，AbPMT1的编码区是一段长度为1011bp的序列，可编码336个氨基酸，而AbPMT2编码区是一段长度为1023bp的序列，能够编码340个氨基酸，将这两种基因转入颠茄毛状根中发现，AbPMT2基因在颠茄毛状根中的表达量要远远地高于AbPMT1基因的表达量。

三分三与颠茄一样，均具有两个PMT基因（AaPMT1和AaPMT2）。研究发现，在三分三的根、叶和茎中，均有AaPMT1和AaPMT2这两种基因的表达，且AaPMT2基因在各组织中表达量低于AaPMT1基因。AaPMT1与AaPMT2分别为长度1017bp、1041bp的基因序列，分别能够编码出338个、347个氨基酸。同时，将诱导子茉莉酸甲酯（MeJA）添加到毛状根中，发现诱导子的添加能显著地提高AaPMT1的表达。

将PMT基因转到不同具有相同托品烷类生物碱次生代谢途径的植物中（颠茄、三分三、烟草、黑莨菪和澳洲毒茄）发现[9]，将烟草的PMT基因转入颠茄和澳洲毒茄中使其过量表达，与对照相比，东莨菪碱与莨菪碱的含量均不存在显著性差异。有研究发现，将烟草的PMT基因转入到颠茄中，使其在颠茄中过量表达，结果表明，PMT酶的活性与对照相比提高了5倍，但是由其可以催化生成的东崀菪碱和莨菪碱的含量并没有提高，说明了在颠茄中，外源物种的PMT基因过量表达并不能促进此生代谢产物托品烷类生物碱的合成。

但将PMT基因转入到转基因黑莨菪毛状根中，使其在毛状根中过量表达，莨菪碱的含量与对照相比提高了5倍。同样，将烟草PMT基因在白花曼陀罗毛状根中过量表达，托品烷类生物碱的含量与对照相比都有较大的提高。综上研究可以猜测，PMT是白花曼陀罗和黑莨菪在合成托品烷类生物碱途径中的限速酶，但不是颠茄次生代谢产TAs合成途径中的限速酶。

5、结语

综上所述，提高次生代谢产物合成途径中的限速酶的表达量，可以在一定程度上提高次生代谢产物的产量。关键酶是托品烷类生物碱代谢工程的一个遗传改造的靶点，对托品烷类生物碱含量的提高具有明显的效果，同时可为后人利用基因工程技术获取高产托品烷类生物碱提供参考，解决托品烷类生物碱含量低的上问题。

参考文献：

[1]裴鉴,周太炎.中国药用植物志(第三册)[M].北京:科学出版社,1953.

[2]林启寿.中草药成分化学[M].北京:科学出版社,1977:711.

[3]卢衍.颠茄pmt､trI､h6h双基因策略对颠茄毛状根托品烷类生物碱含量的影响[D].重庆:西南大学,2012.

[8]强玮.颠茄trⅠ基因的克隆､功能验证及超量表达对颠茄托品烷生物碱合成的影响[D].重庆:西南大学,2012.

刘佳,肖倩.颠茄生物碱代谢过程中关键酶的研究概况[J].生物化工,2020,6(04):123-125.

基金:西安培华学院校级资助项目(PHKT19071).