真菌性角膜炎(FK)是由致病真菌引起的一种侵袭性角膜感染性疾病，通常会导致严重的视力损害，甚至伤害整个眼球[1]。FK的致病菌主要是镰刀菌、曲霉菌和念珠菌，其中茄病镰刀菌(F.solani)是中国导致FK的主要病原微生物，占25%-73.3%[2]。研究表明，临床治疗FK的疗效主要取决于人体清除病原真菌的能力和病原细菌的毒力。然而，由于毒性、副作用和耐药性的产生，现有药物在抗真菌治疗中的临床效果十分有限。开发新的有效抗真菌药物对于FK的治疗具有重要临床价值。磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路是机体内研究最广泛的信号通路之一，参与调控多种生物学功能[3]。近年来对该通路的研究表明其参与不同微生物的感染和致病过程，并在多种角膜疾病中发挥作用[4]。基于PI3K/AKT通路探讨与真菌感染的免疫调节和角膜免疫抗真菌感染相关的药物可能为FK的治疗提供新思路。丁香酚(4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是苯丙烷类化合物和丁香的主要成分，已被证实具有广泛的药理学活性，包括抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗真菌等[5-6]。然而，其在镰刀菌感染引起的FK中的作用尚未见报道。基于此，本研究旨在探讨丁香酚对镰刀菌诱导的小鼠FK的保护作用，并观察PI3K/AKT通路和炎症反应的变化，以期为疾病的治疗提供一定参考价值。

1、材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物

SPF级雄性Balb/c小鼠(20-22 g, 8-10周龄)54只购自安徽智飞龙科马生物制药有限公司[许可证号SYXK(皖)2019-007]。实验前通过裂隙灯显微镜观察小鼠角膜确定角膜无任何病变，以每只小鼠的左眼作为空白对照，右眼用于造模。动物的饲养条件和实验过程均符合视觉与科学研究协会制定的科研动物使用规范。本研究经医院伦理审批委员会讨论通过(2023-029-01)。

1.1.2药物及主要试剂

茄病镰刀菌标准菌株(编号AS3.1829)购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。丁香酚(C10H12O2,≥98%,产品编号CFN99175)购自武汉ChemFaces公司，见图1。将丁香酚以640 mg/mL作为储备溶液溶解在二甲基亚砜(DMSO)中，并调整浓度为160μg/mL备用。小鼠白介素-6(IL-6)和白介素-1β(IL-1β)酶联免疫吸附试剂盒购自碧云天生物科技有限公司。PI3K/Akt通路激活剂类胰岛素生长因子-1(IGF-1)购自Sigma公司。抗PI3K抗体、抗磷酸化PI3K(p-PI3K)抗体、抗Akt抗体、抗磷酸化Akt(p-Akt)抗体、抗GAPDH抗体分别购自R&D Systems(Minneapolis, MN)、Epitomics(Burlingame, CA)、Cell Signaling Technology(Danvers, MA)和Sigma(St. Louis, MO)公司。

1.2方法

1.2.1真菌菌液制备

将冷冻干燥镰刀菌菌种溶解于无菌生理盐水中制备悬浮液，将镰刀菌悬浮液接种于Sabouroud低糖琼脂斜面培养基(4%葡萄糖、1.0%蛋白胨，pH4.0-6.0)中，置于28℃恒温箱中培养7 d。将生长良好的镰刀菌菌种置于4℃冰箱中保存。造模前1 wk,将冷藏的镰刀菌菌种转移至28℃恒温箱中培养2 d,随后接种于Sabouroud低糖琼脂斜面培养基中培养3 d。取出培养基，用2 mL无菌生理盐水冲洗菌面，收集含真菌孢子和菌丝成分的镰刀菌混悬液。镰刀菌混悬液经0.9%无菌生理盐水稀释后，于红细胞计数板上对镰刀菌分生孢子数进行计数，调整接种浓度为108集落形成单位(colony forming unit)/毫升。镰刀菌混悬液需即配即用。

1.2.2分组及处理

将小鼠随机分为3组，每组18只：DMSO组、丁香酚组、IGF-1组。丁香酚组将4μL丁香酚(160μg/mL)涂抹至小鼠右眼结膜囊进行治疗，每天3次[7]。IGF-1组除使用丁香酚外，还于右眼结膜囊涂抹4μL PI3K/AKT通路激活剂IGF-1(10 nmol/mL),每天1次。DMSO组小鼠右眼结膜囊涂抹等量DMSO(0.05%)。

1.2.3模型构建

采用改良的表层镜法[8]制备FK小鼠模型。小鼠经0.6%戊巴比妥钠麻醉后，修剪胡须。使用0.4%盐酸奥布卡因滴眼液滴入小鼠右眼进行浅表麻醉。于手术显微镜下，用镊子固定小鼠眼睛，暴露小鼠右眼角膜，结膜下滴入分组药物。1 h后，用电动角膜上皮刮板刮除角膜上皮，使用微型注射器在右眼角膜基质注射2.5μL镰刀菌悬浮液。随后，在小鼠的角膜表面覆盖软性角膜接触镜。为确保建模的均一性及稳定性，用7-0缝线在眼睑中央缝合一针使其闭合。术后，于睑裂表面涂氧氟沙星眼膏。术后24 h拆除眼睑缝线，取出软性角膜接触镜。分别在接种镰刀菌悬浮液的第1、3、5 d,每组各随机选择6只小鼠，裂隙灯下观察角膜形态，并对角膜病理改变进行临床评分，然后注射过量麻醉剂处死小鼠，收集右眼角膜组织，一部分角膜组织用于组织病理学分析[苏木精伊红染色(HE)],一部分角膜组织制备匀浆，用于载菌量检测、酶联免疫吸附试验(ELISA)和蛋白免疫印迹分析。

1.2.4角膜形态检查及临床评分

于HAAG-STREIT型裂隙灯显微镜下观察角膜形态，采用Ⅰ-Ⅳ级评分对角膜病理改变进行临床评分，单个眼角膜临床评分为三项观察指标的分级相加所得总分，量化标准见表1[8]。

图1丁香酚的化学结构式。

1.2.5 HE染色

将小鼠角膜组织用4%甲醛固定过夜。在梯度乙醇中脱水后，石蜡包埋，切片(厚度5μm),二甲苯脱蜡，梯度乙醇再水化，漂洗5次。将组织切片浸入苏木精溶液中染色5 min,然后在伊红溶液中浸泡2 min,梯度酒精脱水，中性树脂封片。在光学显微镜下观察切片的病理变化。

1.2.6角膜组织载菌量检测

角膜匀浆液配制：取10 mL Na2EDTA溶液(0.1 mol/L)和50 mL Tris-Cl溶液，加入440 mL超纯水充分混匀后，使用0.02μm滤过膜抽滤后，除菌，备用。小鼠角膜组织充分剪碎后，加入配制好的角膜匀浆液500μL,于冰上以18 000 r/min破碎匀浆30 s。将破碎后的角膜匀浆液以1∶100进行稀释。使用微量进样器吸取50μL匀浆液进行涂板，并置于28℃恒温箱中培养3 d,随后进行菌落计数。载菌量即为菌落计数乘以稀释倍数。

1.2.7 ELISA

角膜组织匀浆处理后，于3 000r/min离心30 s,收集上清液。采用小鼠IL-6(货号PI326)和IL-1β(货号PI301)酶联免疫吸附试剂盒检测上清液中IL-6和IL-1β的含量，具体实验步骤参考试剂盒说明书进行操作。

1.2.8蛋白免疫印迹

将小鼠角膜组织块置于EP管中，蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解。BCA法测定蛋白浓度。将20μg蛋白质在10% SDS-PAGE上分离，然后转移到PVDF膜上。5%脱脂奶封闭2 h,一抗[抗PI3K抗体(1∶1 000)、抗p-PI3K抗体(1∶1000)、抗Akt抗体(1∶1 000)、抗p-Akt抗体(1∶1 000)、抗GAPDH抗体(1∶2000)]4℃孵育过夜，相应二抗室温孵育1 h。采用化学发光法显影，并使用Gel-proAnalyzer 4.5图像分析软件进行目的条带的灰度分析。

统计学分析：采用SPSS22.0统计软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差

表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1丁香酚对FK小鼠角膜形态及临床评分的影响

感染后第3 d, DMSO组、丁香酚组与IGF-1组小鼠右眼均表现出明显的FK临床特征，包括弥漫性角膜水肿、溃疡和炎症，其中丁香酚组病理损害和角膜新生血管反应最轻；感染后第5 d, DMSO组与IGF-1组小鼠症状均进一步加重，透明度低，透过病灶窥不见虹膜，而丁香酚组溃疡趋于愈合，病灶区域缩小，炎症减轻，见图2。感染后第3、5 d,与DMSO组相比，丁香酚组临床评分均明显降低(P<0.05),且丁香酚组临床评分明显低于IGF-1组(P<0.05),见表2,图3。

2.2丁香酚对FK小鼠角膜病理组织损伤的影响

HE染色显示，DMSO组和IGF-1组小鼠感染第3 d角膜边缘充血、水肿，角膜增厚和新生血管形成；感染第5 d可观察到角膜严重损伤，如炎性细胞浸润、局部溃疡或穿孔；丁香酚组小鼠感染第3 d角膜病理组织损伤较严重，第5 d炎症症状即明显减轻，见图4。

表1角膜病理改变进行临床评分

图2裂隙灯下观察小鼠角膜镰刀菌感染第1、3、5 d的角膜形态。

表2小鼠角膜镰刀菌感染第1、3、5 d的临床评分比较

图3小鼠角膜镰刀菌感染第1、3、5 d的临床评分比较

图4 HE染色观察镰刀菌感染第1、3、5 d的组织病理损伤。

2.3丁香酚对FK小鼠角膜组织载菌量的影响

各组小鼠角膜真菌载量均随时间推移呈下降趋势。感染第3、5 d,与DMSO组相比，丁香酚组角膜载菌量明显降低(均P<0.05),且丁香酚组角膜载菌量明显低于IGF-1组(均P<0.05),见图5。

2.4丁香酚对FK小鼠角膜组织炎症介质的影响

感染第3 d,与DMSO组相比，丁香酚组角膜组织IL-6水平明显升高，而IL-1β水平明显降低(均P<0.05);丁香酚组角膜组织IL-6水平明显高于IGF-1组、IL-1β水平明显低于IGF-1组(均P<0.05)。感染第5 d,丁香酚组角膜组织中IL-6和IL-1β水平均明显低于DMSO组和IGF-1组(均P<0.05),见图6。

2.5丁香酚对PI3K/AKT信号通路的影响

感染第3、5 d,与DMSO组相比，丁香酚组角膜组织中p-PI3K和p-Akt表达均明显降低(P<0.05),且丁香酚组角膜组织p-PI3K和p-Akt表达明显低于IGF-1组(均P<0.05),见图7。

图5各组小鼠角膜真菌载量的比较

aP<0.05 vs丁香酚组。

3、讨论

FK是一种侵袭性极强的角膜损伤性急症，由于病情发展迅速，通常会导致严重的视力损伤。镰刀菌是中国最常见的FK病原体之一，具有很强的毒力和侵袭性。然而，目前临床上尚缺乏针对镰刀菌的有效抗菌药物，因此镰刀菌感染的FK患者预后较差[9]。探索有效的治疗靶点和药物以调控角膜炎症的发展，对于改善患者预后至关重要。

图6各组小鼠角膜组织中炎症介质水平的比较

A:IL-1β水平；B:IL-6水平。aP<0.05 vs丁香酚组。

图7各组小鼠角膜组织中PI3K/AKT通路相关蛋白表达的比较

A:蛋白免疫印迹检测；B:p-PI3K/PI3K水平；C:p-AKT/AKT水平。aP<0.05 vs丁香酚组。

丁香是一种重要的药用植物，因其广泛的药理作用作为民间医药被广泛使用。丁香油可用于治疗许多疾病，包括痤疮、哮喘、类风湿性关节炎、疤痕、疣和各种过敏症；在牙科医疗实践中，丁香油还被用作镇痛剂、解痉剂和防腐剂[10-11]。精油的抗菌活性通常取决于其化学成分和每种活性成分的数量，这是所有天然植物提取物的共同特点。丁香酚是从丁香油中分离出的最主要生物活性成分，每100 g新鲜植物材料中含有9 381.70-14 650.00 mg的丁香酚[12],而丁香油的抗菌活性主要与丁香酚含量高有关。丁香酚的抗真菌活性已被广泛研究。早在1982年，Boonchird等[13]已评估了丁香酚对31株白僵菌和33株新型隐球菌的抗真菌活性进行了评估。Prajapati等[14]发现，丁香酚可诱导酿酒酵母和白色念珠菌包膜的形态改变，而包膜形态与这些真菌的致病性密切相关。Shahina等[15]发现，丁香酚可诱导白色念珠菌产生氧化应激反应，造成细胞质膜脂质过氧化和细胞死亡。此外，丁香酚也被证实可在体内和体外对免疫抑制大鼠口腔念珠菌病发挥抗菌活性[16]。最重要的是，Yu等[7]证实丁香酚可通过减少真菌负荷来预防烟曲霉角膜炎。本研究发现，与DMSO组小鼠相比，丁香酚处理组小鼠的角膜病理损伤和角膜新生血管反应更轻，角膜真菌清除速度更快，证实了丁香酚对镰刀菌引起的FK的抗真菌作用。

炎症是对抗病原微生物的关键防线。真菌感染早期，角膜即启动依赖于模式受体(PRRs)如Toll样受体(TLRs)的先天性免疫应答[17-18]。PRRs的激活会引发各种炎症事件，包括炎症细胞的浸润和促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6)的产生。这些PRRs介导的炎症反应是真菌清除所必需的。然而，如果不加控制，过度的宿主炎症反应也会进一步导致病理组织损伤。因此，在眼部免疫防御中精确平衡促炎和抗炎反应十分重要。丁香酚的抗炎作用已被广泛研究。已证实，丁香酚可通过降低炎症反应改善特定器官的功能[19]。在金黄色葡萄球菌感染的大鼠中，丁香酚除发挥抗菌作用外，还可通过增加毛细血管数量、减少炎症细胞来促进伤口愈合[20]。本研究发现，在镰刀菌感染第3 d小鼠角膜IL-6显著升高。同时，丁香酚组小鼠在感染前期IL-6表达水平明显高于DMSO组，而感染后期IL-6表达明显低于DMSO组。此外，丁香酚组感染前期与后期IL-1β表达均明显低于DMSO组。作为重要的促炎细胞因子，IL-1β和IL-6通过激活多种反应，在宿主抵抗病原微生物的过程中发挥重要作用。IL-1β是由免疫细胞产生的Th1型细胞因子，其主要功能是增强炎症反应[21]。IL-6是急性期反应的强诱导物，能参与促进炎症反应的恢复。IL-6的表达是小鼠FK中机体重要的防御和保护因素[22]。基于这些结果推测，在镰刀菌感染急性期，丁香酚能够促进IL-6介导的急性期炎症反应，从而有助于真菌的早期清除；同时，通过抑制IL-1β介导的炎症反应，减轻感染后期的病理损害。因此，除抗菌作用外，丁香酚能够通过调节炎症因子分泌改善镰刀菌感染引起的角膜炎。

PI3K/AKT信号通路作为目前研究最广泛的典型信号通路之一，已被证实参与调控细胞凋亡、转录、翻译、新陈代谢和细胞周期等多种细胞生物学过程。在炎症性疾病中，PI3K/AKT信号通路会被异常激活，而且该通路的异常激活与炎症的发生和发展密切相关[23]。近年来的研究表明，PI3K/AKT信号通路与不同微生物的感染和发病机制有关，并对各种角膜疾病产生重要影响。值得注意的是，Yeh等[24]证实，PI3K/AKT信号通路在镰刀菌感染的FK小鼠体内被激活，这与本研究中的结果一致。在细菌性角膜炎中，通过调控PI3K/AKT通路产生的免疫调节作用可抑制炎症并延缓角膜炎的进展[25-26]。在单纯疱疹病毒感染后的角膜组织中，p-PI3K和p-AKT明显增加，提示这一信号通路可能参与介导角膜炎的发生进展[27]。在FK中，假交替单胞菌胞外多糖EPS-Ⅱ能够抑制白色念珠菌对角膜上皮细胞的黏附，这可能是通过抑制PI3K/AKT信号传导以降低了相关炎症因子的水平来实现[28]。这些结果提示，PI3K/AKT信号通路在FK免疫调节中起着至关重要的作用，靶向PI3K/AKT通路可能成为FK的潜在治疗靶点。本研究发现，丁香酚能够降低PI3K和AKT的磷酸化水平，提示丁香酚能够抑制PI3K/AKT信号通路激活。为进一步确定丁香酚在FK小鼠中的作用机制，本研究也使用了PI3K/AKT通路激活剂IGF-1进行挽救实验。与预期一致，本研究发现，IGF-1可在一定程度上消除丁香酚对PI3K/AKT信号通路的抑制作用。同时，丁香酚对FK小鼠角膜组织损伤的改善及促炎细胞因子分泌的抑制作用均能够被IGF-1所逆转。这些结果证实丁香酚可能通过抑制PI3K/AKT通路的活化来发挥抗炎效应，从而促进角膜抗真菌过程中的先天免疫，加速FK愈合，在FK小鼠中发挥保护作用。

然而，本研究仍存在一些不足：(1)丁香酚应用在眼部的生物利用度仍需要探讨。(2)本研究未对全身免疫程度进行评估，针对FK选择合适的治疗时机还有赖于机体免疫状态、感染严重程度、开始用药时间等，如何合理把握给药时机、剂量仍有待进一步研究。(3)本研究仅以PI3K/AKT信号通路为切入点，并以丁香酚联合应用激活剂进行挽救实验，确定丁香酚能够抑制PI3K/AKT信号通路活化。未来有必要以PI3K/AKT信号通路抑制剂作为阳性对照，或者选择更多信号通路进行深入研究。(4)丁香酚的治疗效果是否与不同的真菌菌株种类有关仍有待进一步探索。

综上所述，丁香酚通过抑制PI3K/AKT通路来减轻镰刀菌引起的角膜炎症，从而提高小鼠对病原微生物的抵抗力。

参考文献:

[1]周晓丹,杨玉倩,徐强崧.真菌性角膜炎的致病菌菌属和转归及其影响因素分析.国际眼科杂志,2022,22(11):1892-1895.

[2]黄光怡,唐宁宁,陈琦,等.基于迁移学习和数据增强策略构建真菌性角膜炎镰刀菌属鉴定的智能诊断系统.国际眼科杂志,2022,22(5):736-740.

基金资助:海南省重点研发计划项目(No.ZDYF2021SHFZ232)~~;

文章来源:丁辉,胡施思,杨镇朵,等.丁香酚通过PI3K/AKT信号通路减轻镰刀菌诱导的角膜炎症[J].国际眼科杂志,2024,24(08):1194-1199.