沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科沙棘属落叶灌木或小乔木,是荒漠化防治和水土保持的重要生态、经济树种,在亚欧大陆分布广泛,一般存在于温带、寒温带等地区,还有一些亚热带高山区,在北美地区引种栽培也进行了实验观察[1]。我国沙棘资源比较丰富,遍及西南、西北、华北和东北等区域。沙棘果实富含维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸等多种生物活性物质,可以增强人体免疫及抗肿瘤等机能[2,3]。沙棘也具有较好的经济效益,其果实具有丰富的营养,作为食品原料广泛应用,还具有抗氧化等功效,广泛应用于保健品和化妆品中。目前,沙棘在我国已经发展成为一种重要生态经济型树种。

沙棘木蠹蛾(Eogystiahippophaecolus)、红缘天牛(AsiashalodendriPalla)、沙棘绕实蝇和沙棘象鼻虫(Elaeidobiuskamerunicus)是危害沙棘的主要害虫。其中,沙棘木蠹蛾是严重危害沙棘林的重大钻蛀性害虫。辽宁省建平县曾有1530hm2沙棘林,是世界上规模较大的人工沙棘林之一,但由于干旱、虫害等生物非生物胁迫等原因,给这个人工沙棘林带来巨大的破坏,同时也影响了相关的沙棘产业[4]。

红缘天牛属天牛科,一年一代,跨越两个年度,其幼虫蛀食长势较弱的树干,成虫取食沙棘嫩叶及嫩枝[5]。沙棘绕实蝇是危害沙棘果实的主要害虫[6,7],自1985年在辽宁省建平县首次发生危害以来[8],先后在内蒙古巴彦淖尔和新疆阿勒泰地区的沙棘林中暴发成灾,导致沙棘果实几近绝收,对相关的食品和药用加工企业造成了巨大的经济损失。沙棘象鼻虫也是危害果实的主要害虫,其主要通过取食沙棘幼果的种仁(而非果汁)获取营养。取食时,成虫以喙管穿入果皮,并以喙管插入点为中心,每粒果实只取食一次。每头成虫每天取食4～9粒果实[9]。上述害虫大发生时,均给沙棘产业造成巨大的经济损失。

目前,林木抗虫机制及通过基因工程培育抗虫新品种是抗虫性研究的主要方向,而植物抗虫基因的挖掘及其在林木分子育种中的应用更是研究的热点。鉴于此,本文详述了沙棘主要害虫的抗虫性机制及分子育种研究展开详述,并提出相关抗虫基因工程、抗虫分子机制及展望,以期为我国沙棘抗虫性研究提供一定的理论基础,并为抗虫沙棘分子育种改良与应用提供科学依据。

1、沙棘的抗虫机制

林木与昆虫长期互作,协同进化,形成了组成型和诱导型两种防御性机制。组成型防御性机制是由遗传因素影响决定的,植物会形成一种物理或化学因子,通过防止害虫取食达到保护植株的效果;诱导型防御性机制是由病原菌侵染或是机械损伤等诱导产生的免疫应答反应[10]。

1.1 组成型抗虫防御

组成型防御是植物本身具有的,分为物理组成型抗虫防御和化学物质组成型抗虫防御,受外界因素影响较小。

1.1.1 物理组成型抗虫防御

物理防御是指林木在长期进化过程中形成了多种防御害虫入侵的外部形态特征和内部组织结构,形成物理防御系统来阻止害虫对沙棘果实的伤害行为[11]。如针叶树筛管丝团中混有的草酸钙晶体也可有效抵抗树皮甲虫[12];柳蓝叶甲幼虫更易取食被去除绒毛的柳树嫩叶[13];美国西部白松(Pinusbungeana)外皮层含有较多的树脂道,对沙棘象鼻虫具有一定的抗性[14];奥利维尔甲虫的幼虫只能以桉树比较幼嫩的叶片作为食物[15]。

物理防御机制是一些大型乔木和裸子植物的常见防御类型,但在胡颓子科沙棘属落叶性灌木的相关研究报道较少,赵延霞等[16]分析了6个沙棘亚种(品种和杂交种)根、茎和叶的组织结构特征及其与沙棘木蠹蛾抗性的关系,明确了沙棘叶背、叶面表面皮毛与沙棘抗虫性之间的关系。

本课题组前期通过电镜扫描发现,不同抗、感沙棘植株的叶片表皮,果皮以及茎的表面均分布着大量的鳞片状毛状体。其中在抗虫植株的表皮组织中毛状体分布密集,且在叶片下表皮和果皮中有重叠现象;而敏感植株表皮中的毛状体相对稀疏(图1)。

进一步对沙棘绕实蝇的产卵选择性进行了测定,发现在敏感植株叶片、茎和果实上的产卵数量均高于抗虫植株[17],表明绕实蝇成虫偏向于选择毛状体分布少的沙棘作为主要产卵寄主。由此推测,毛状体的分布密度是影响沙棘绕实蝇产卵选择性差异的重要因素,即沙棘表皮毛状体与抗虫性密切相关,沙棘可通过增加毛状体分布密度来进行物理防御。

图1不同抗、感无性系毛状体分布密度差异[16]

1.1.2 化学物质组成型抗虫防御

化学物质组成型防御是植物利用本身固有的对害虫具有抗性的化学物质实现抗虫功能。这些化学物质主要分为两类:一类主要有核酸、蛋白质、糖类和脂类等初级营养物质。如白桦(Betulaplatyphyll)随着昆虫的生长,存在于叶片中的两种糖含量会降低[18];毛白杨(Populustomentosa)抗虫性受到无性系树皮内总糖含量的影响,含量高的时候毛白杨抗虫性较差[19];木质部碳水化合物含量较低有利于幼虫取食[20];脂肪酸类物质可通过渗透和堵塞白纹伊蚊呼吸道并覆盖呼吸细胞表面,造成呼吸系统细胞膜破坏对昆虫达到致死作用[21]。另一类主要是植物的次生代谢物,为了应对植物遇到的生物胁迫与非生物胁迫,会产生萜烯类、酚类和含氮化合物,这些物质的合成和分布具有特异性[22]。

综上,物理与化学防御的共同作用是植物最常见的基础防御。基于此,可从沙棘物理、化学物质等组成型防御角度对沙棘抗虫性机制及开发利用深入开展相关工作。

1.2 诱导型抗虫防御

诱导型防御是树木受到侵害时,通过激发基因调控表达改变自身的理化性质来达到防御目的[23]。诱导型防御系统具有保守、复杂、精密的特点,并具有持续性、传递性等特点。这个系统会让植物自身产生大量的次生代谢产物以及防御蛋白,以此形成一个复杂的防御体系,当昆虫取食时,植物与昆虫进行接触互作,启动防御系统来应对昆虫摄食带来的病原菌并有效抵御害虫侵害[24]。林木的诱导型防御主要包括可诱导的化学防御、蛋白防御和生态防御等类型[18]。

1.2.1 化学物质诱导型抗虫防御

化学物质诱导防御是植物的主要防御方式之一,受到昆虫侵害时植物会产生低分子量酚类、萜类及生物碱类物质,这些物质具有抗菌性和毒性,并抑制摄食昆虫的消化吸收繁殖等生理功能。有研究发现,拥有抗虫基因的白云杉植株被云杉蚜虫取食后,酚类化合物pungenol和piceol合成量显著增加,使昆虫的取食量受到显著影响,有效保护植物自身[25]。

1.2.2 蛋白抗虫防御

蛋白防御是一个复杂的系统,在这整个防御网络中主要涉及氧化水解酶和蛋白抑制剂,主要功能是抗菌,抑制幼虫生长和昆虫的营养吸收。PR-3蛋白家族具有抑制昆虫生长的作用,通过破坏真菌细胞壁及细胞膜来完成,而PR-6蛋白家族则被发现具有抑制昆虫营养吸收的作用,是一些昆虫的消化酶抑制剂[26]。除此之外,多酚氧化酶还有减少昆虫吸收氨基酸的作用,抑制昆虫对植物营养摄取消化,作用机制是通过氧化被取食植物种的酚类物质成为醌类化合物,醌类化合物再与昆虫肠道蛋白交联达到目的[27]。

1.2.3 生态抗虫防御

生态防御主要是通过“宿主-昆虫-天敌”的取食关系来实现的。如北美香柏(Thujaoccidentalis)根部受到黑象甲(CosmopolitessordidusGermar)幼虫侵害时,会释放乙酸叶醇酯来吸引其天敌杆线虫(Ceanorhabditiselegans)[28]。植物与植食性昆虫在长期的相互过程中形成了多种防御机制,进而快速适应环境。上述防御机制在其他林木抗虫功能研究中已有广泛报道,这为进一步深入研究各种诱导防御机制参与沙棘抗虫的调控过程提供了重要的理论依据。

本课题组前期对抗、感沙棘植株抗绕实蝇研究中发现,抗、感沙棘无性系中分别含有醛类、酯类、醇类、酸类、酚类和甲基硫等多种化学防御物质。其中,抗虫沙棘植株中酯类物质含量明显低于敏感植株,而醛类物质含量明显高于敏感植株,这些化学物质直接或间接参与了沙棘抵御绕实蝇的防卫。同时,在绕实蝇产卵盛期,抗虫沙棘无性系内可溶性蛋白和脯氨酸等防御蛋白含量均显著高于与敏感无性系,表明沙棘植株可以通过产生化学防御物质来抵御绕实蝇的危害[17]。

1.3 激素相关信号通路介导的植株抗虫机制

昆虫从植物中摄取营养物质有多种手段,同时植物应对昆虫的侵害也进化出了多种防御机制,如可通过转录因子调控茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)和乙烯(ET)等信号途径[29]参与植株的防御防卫。植物WRKY转录因子既可通过参与JA、ET和SA信号代谢途径,也可作用于下游靶基因来提高植株的抗逆性[30,31,32,33]。如火龙果(Hylocereuspolyrhizus)HpWRKY44可通过调控下游靶基因CYP450-like1的表达,从而表现出对不同逆境的应答反应[33];陆地棉(Ghossypiumhirsutum)GhWRKY40基因通过调控MPK-WRKY-茉莉酸(JA)或ET信号通路来提高植株对白粉虱(Trialeurodesvaporariorum)的抗性[34];水稻(Oryzasativa)OsWRKY24/70/53/45通过影响乙烯(ET)信号途径来参与调控抗褐飞虱(Nilaparvatalugens)反应[35,36,37]。还有研究发现,大豆(Glycinemax)WRKY家族成员受水杨酸(SA)信号通路诱导提高了植株抗大豆胞囊线虫的能力[38]。

尽管国内外学者在WRKY转录因子信号通路等方面开展了一些研究,但多集中在模式植物拟南芥、水稻及经济作物大豆和棉花中,有关胡颓子科植物WRKY成员分子特征及介导毛状体分布密度参与抗虫的分子机制,迄今未见有相关论文发表。本课题组利用沙棘转录数据,获得了沙棘HrWRKY基因家族成员48个,其中HrWRKY44与拟南芥AtWRKY44有同源性,据此推测沙棘HrWRKY44可能通过某种信号途径参与了植株毛状体的形态建成,进而提高了植株的抗虫性。

2、沙棘抗虫性分子育种研究

目前,林木抗虫育种主要是利用抗性资源进行常规育种,但由于林木抗虫的复杂性以及林木、昆虫互作机制研究的局限性,林木抗虫育种一直是林业生产上的重大科学问题。近年来分子育种技术的快速发展为林木抗虫育种提供了有效的探索途径,各研究学者对抗虫基因进行了深入研究,发现并挖掘植物中的各种抗虫基因病,深入研究植物体内的各种抗虫机制,为林木抗虫基因工程育种提供了大量资料。目前已对多种树种的分子抗虫机制进行了深入研究,通过转基因获得抗性植株,其中很多研究成果已经投入到了生产应用中[39,40]。与上述林木相比,有关沙棘抗虫相关的常规育种或分子育种研究鲜见报道。本课题组在中国林业科学研究院沙漠林业实验中心经过数年的调查,发现了少量的高抗绕实蝇沙棘植株,开展了生理水平、挥发性物质和次生代谢物质等方面的研究,发现一些次生代谢物质不同程度参与了植株的抗虫性[17]。这些具有抗虫优良性状的植株为深入研究沙棘抗虫的分子机制提供了重要的种质资源。

2.1 分子标记辅助育种

种质资源的鉴定是林木育种的重要保障,同时为林业科研和生产也提供很大帮助。传统的形态学和生化鉴定方法已无法满足科研、生产需要,随着深入研究以及科技发展,发现了分子标记技术,从分子的角度对林木种质资源进行鉴定和纯度分析研究。如Fossati[41]通过AFLP分子标记技术,将形态上不能区分的天然欧洲山杨、银白杨、银灰杨的杂种区进行区分。Ruan和Li[42]用RAPD分析了来自中国、俄罗斯、蒙古的14个不同沙棘品种的遗传关系。沙棘在品种筛选过程中已运用了分子标记辅助育种技术,但还未运用到沙棘抗虫性研究中。由此可见,寻找与经济性状紧密连锁的分子标记,为沙棘分子标记辅助育种提供可靠的科学依据,对培育沙棘抗虫品种具有重大帮助。

2.2 转基因抗虫育种

转基因作为重要的生物技术,在林木抗虫育种工作中广泛应用。通过DNA重组技术,将一些外源带有抗性的目的基因导入到林木染色体中,从而使外源抗虫基因表达,表现出抗虫性。目前研究表明,林木的抗虫基因主要来源是微生物源、植物源、动物源,如蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂等[43]。转基因作为重要的生物技术,在林木抗虫育种工作中广泛应用。通过DNA重组技术,将一些外源带有抗性的目的基因导入到林木染色体中,从而使被转移林木产生具有外源抗虫基因表达,表现出抗虫性。目前研究表明,林木的抗虫基因主要来源是微生物源、植物源、动物源,如蛋白酶抑制剂、淀粉酶抑制剂等。农杆菌转化、基因枪法和显微注射法是比较常见的转基因方法,其转入的外源基因均是完整的ORF框,片段较长,插入具有一定的随机性,而目前最热门的基因编辑技术,转化的仅仅是一个20nt左右的片段,且能定点插入,具有精确改良与编辑目标片段的效果,该方法已经广泛用于动物和一些模拟植物及经济作物中,但在林木上开展研究还鲜见报道[44],而目前最热门的基因编辑技术在林木上还鲜见报道。

在抗虫基因研究领域,利用分子标记法已在多个树种上构建遗传图谱,通过克隆定位抗虫的基因位点进行研究。毛状体形态特征及分布密度是植株抗虫性状筛选的重要依据之一,而WRKY转录因子可以调控植株毛状体分布密度和形态建成过程。拟南芥(Arabidopsisthaliana)中AtWRKY44(又称TTG2)是一个与表皮毛状体和种皮发育相关的转录因子,也是首次揭示与植物形态发育有关的转录因子,且发现拟南芥AtWRKY44突变体植株的叶表面毛状体分布密度降低,形态上无分支[26];番茄(Solanumgalapagense)中SgWRKY基因的表达可以增加植株叶片毛状体分布密度,从而提高其对白粉虱(Bemisiatabaci)的抗性[45]。向日葵(Helianthusannuus)HaWRKY转录因子调控参与头状花序边花中毛状体的分布密度,提高了植株抗虫性[46]。本课题组发现,沙棘毛状体分布密度与抗虫性密切相关,因此,可基于分子标记构建遗传图谱或沙棘转录组数据挖掘WRKY转录因子家族成员,并解析其如何调控沙棘抗绕实蝇的生物学功能及作用机制,为沙棘抗虫分子育种进行遗传改良提供重要参考。

2.3 沉默基因抗虫育种

RNA干扰技术主要是通过双链RNA引发的基因沉默,是一些存在于昆虫体内的重要基因在转录后表现的机制,为植物抗虫防御方面起着很重要的作用。表达Snf7dsRNA的转基因玉米可以有效的防御玉米根部受到西部玉米根虫的侵害,其机理是该基因可以通过干扰昆虫的Snf7基因表达基因沉默来影响其体内液泡的分选过程使昆虫取食受到影响或者导致其死亡的基因表达[47]。此外,通过Crisp/Cas9基因编辑技术的反义遗传学手段可以诱导玉米[47]、拟南芥[48]和水稻[49]等植物基因突变,比如基因组缺失突变、特殊序列替换或插入,可调节基因组内特异目标位点。最近研究表明,利用Crisp/Cas9技术将杨树油菜素内酯合成相关的PtDWF4基因沉默后,抑制了杨树幼苗的生长发育[50]。目前基因编辑技术在林木中的应用实例相对于其他植物的研究比较少,但这些技术手段对于沙棘中抗病基因的研究有很大帮助,以此来消除目的植株转基因林木的筛选标记,对外源基因稳定表达及降低嵌合体和变种的产生概率有很大帮助。

综上,基因编辑技术应用于林木抗虫植株虽然成效很好,但是因为技术、管理手段和生物安全等多方面因素,并未进行大规模商业化种植。现阶段,适用于林木可携带多基因并可以稳定转化的载体并不多,将启动子特异性改造后活性也低。现在林木的高效组培再生系统和基因转化体系建成的还不完全,仍存在某些问题。目前大部分抗虫机理还未明确,已知的、进行深入研究的抗虫基因数目有限,还有待开发。沙棘具有独特的生态及经济价值,利用分子生物学手段进一步改良其抗虫性状是目前亟待解决的重要课题。因此,今后应加强沙棘等林木转基因抗虫育种的研究工作。

3、展望

沙棘具有保持水土的生态作用,也具有重要的营养价值及药用价值。但近年来沙棘象鼻虫、沙棘绕实蝇、红缘天牛、沙棘木蠹蛾等害虫已经严重影响到沙棘的正常生长,因此加强对沙棘抗虫性的研究变得至关重要。

在以后对沙棘抗虫性相关研究中需要加强以下几个方面:①重视沙棘基因组的测序工作,树木基因组测序是分子育种的重要基础,是分子育种技术的支撑,这是一项基础性、战略性的工作;②转基因植株抗虫防御物质直接或间接参与植株抗虫的作用机制,应考虑多种防御机制对植株抗虫性所产生的综合影响,深入研究外源基因响应植株抗虫的分子机制,并进一步探索有利于抗虫基因稳定表达的培育环境和措施;③合理利用某些抗虫特征性状,从分子角度获得抗虫关键基因,将其利用在改良沙棘等林木品种的抗虫研究中;④利用转录组学、代谢组学和蛋白质组学等多种组学及分子生物学方法,对抗虫关键基因在调控植株抗虫方面开展生物学功能研究,探明该基因通过调控哪种信号途径或下游靶基因来参与植株抗虫的分子机制;⑤坚持与其他学科沟通交流进行研究,以分子标记技术为主的研究,将林木遗传育种与其他各学科相结合,从分子、细胞、生态、表型方面综合论述评定,整体上从各个学科相互交融中综合分析林木的遗传机制,明确他的数量性状等复杂调控机制,在明确林木自身作用机制的同时,也兼顾他的经济价值,弄清遗传机制,建立数学模型进行分析,为之后的研究打下坚实基础。

总之,作为沙棘科研工作者应该时刻关注植物学抗虫领域的研究进展,学习并借鉴应用新的技术和方法,为沙棘育种方面做出贡献,推动沙棘分子育种科学发展和经济发展,为沙棘抗虫新品种育种和高产提供新的技术手段。

参考文献：

[4]高成龙,杜凯名,王胜梅,等.沙棘木蠹蛾成虫种群发生动态与性诱剂诱捕剂监测技术[J].应用昆虫学报,2017,54(6):971-977.

[5]汪敏捷,刘强.不同温湿度下绿僵菌对红缘天牛幼虫致病力的影响[J].环境昆虫学报,2014,36(2):151-156.

[6]魏建荣,苏智,刘明虎,等.沙棘果实的重要检疫害虫—沙棘绕实蝇的发生与危害[J].内蒙古林业科技,2012,38(4):55-57.

[8]葛葆蔚.沙棘果实蝇防治技术的研究[J].森林病虫通讯,1991(2):24-25.

[9]陈孝达,张学武.沙棘象幼虫空间分布型及防治方法的初步研究[J].沙棘,2001(3):14-17.

[10]朱麟,杨振德,方杰,等.植食性昆虫诱导的植物抗性最新研究进[J].2005,林业科学,41(1):165-173.

[16]赵延霞,骆有庆,宗世祥,等.不同沙棘品种雌雄株叶片解剖结构及抗旱性比较[J].北京林业大学学报,2012,34(6):34-41.

[17]刘建凤,董礼龙,曹丹丹,等.抗绕实蝇沙棘无性系的筛选及相关化学物质和酶活性分析[J].林业科学,2018,54(9):105-112.

[18]李薇,李淑娴.林木抗虫性研究进展[J].西南林业大学学报(自然科学),2018,38(5):180-190.

[19]李淑玲,刘美青.毛白杨无性系树皮有机物质含量与抗性关系的研究[J].河南农业大学学报,2001,35(3):216-220.

[20]何忠,曹红珍,曾菊平,等.马尾松毛虫对马尾松和湿地松的选择与适应研究[J].昆虫学报,2007,50(2):125-135.

[21]余静,王承珠,王杰,等.脂肪酸类物质对白纹伊蚊的触角电生理影响及引诱作用[J].中华卫生杀虫药械,2013,19(3):200-202.

[48]黄格格,张静文,张天豹,等.利用CRISPR技术鉴定拟南芥miR171a的功能[J].中国农业科技导报,2019,21(5):26-32.

[49]尹祥佳,李艳玫,郝楠.CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在水稻育种中的应用综述[J].甘肃农业科技,2017,10:80-83.

刘建凤,姚莹,赵婕,苏智,魏建荣.沙棘抗虫性机制及其分子育种研究进展[J].中国农业科技导报,2020,22(08):108-115.

基金:中国林业科学研究院基本科研业务费专项(CAFYBB2017MB025);国家自然科学基金项目(31370647);河北省自然科学基金项目(C2020201001).